高效液相色谱-串联质谱法测定淡水养殖池塘 水体及鱼虾体内的藻毒素

吴陈涛， 金敏敏， 邓泽融， 段鑫雅, 胡晓斌*

(湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州 313000)

微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是有毒蓝藻产生的代谢物。世界上25%～70%的蓝藻水华污染可产生藻毒素[1]。在已发现的藻毒素中，微囊藻毒素是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大且造成危害最严重的藻毒素种类[2]。其中存在最普遍、含量相对较多且毒性较大的两种微囊藻毒素异构体为MC-LR、MC-RR(L和R分别代表亮氨酸和精氨酸)[3]。

图1 微囊藻毒素分子结构Fig.1 Molecular structure of Microcystins(MCs)

我国太湖地区每年蓝藻爆发时，水体中的藻毒素以MC-LR 为主[4]。世界卫生组织(WHO)推荐的饮用水中藻毒素以MC-LR代表的上限值为1.0 μg·L-1[5]。微囊藻毒素的一般结构如图1所示。目前，测定微囊藻毒素的方法有酶联免疫吸附试验法(ELISA)[6 - 7]、蛋白磷酸酶抑制试验法[8 - 9]、高效液相色谱法(HPLC)[10]、超高效液相色谱法(UPLC)、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)等[11 - 12]。由于MCs的检测对象通常为环境样品，样品基质复杂，干扰大，易产生较高的假阳性比率，且蛋白磷酸酶抑制试验和ELISA 法检测的均为MC的总量，无法区分藻毒素种类。近年来，HPLC和MS联用的方法被广泛用于检测环境样品中的藻毒素。与其它方法相比，该方法具有更高的选择性和灵敏度。本文建立了以固相萃取(SPE)分离富集，高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测水和鱼虾体内的MC-LR和MC-RR的方法，并对淡水养殖池塘水体和鱼、虾体内的MC-LR和MC-RR进行了检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo-Fisher Scientific 公司TSQ-3001型液相色谱-质谱联用仪；Waters Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3mL)。Votex-Genie 2旋涡振荡仪；Sorvall Instruments RC5C高速离心机；Bandelin Sonoplus HD2070超声波清洗仪；A11 basic IKA高速粉碎机；Labconco FreeZone 2.5 L冻干仪；Polytron PT3100匀浆仪；优晟USE-24S 24位固相萃取装置；CM-24型氮吹仪。

MC-LR和MC-RR标准品购自中国国家标准物质研究中心，纯度大于95%。1.0 mg·L-1混合标准溶液:称取2种微囊藻毒素标准品于同一容量瓶中，用甲醇配制成混合标准溶液，于-20 ℃避光保存，用时逐级稀释至所需浓度。色谱纯甲醇、乙腈和甲酸购自德国Merck公司；实验用水由美国Millipore 公司的Milli-Q净水系统制备。

1.2 仪器工作条件

Waters ACQUITYTMUPLC BEH C18 色谱柱(100×2.1 mm,3.5 μm)；流动相：A为含0.1%甲酸乙腈溶液(体积分数，下同)；B为0.1%甲酸的水溶液；流量为0.3 mL·min-1；柱温25 ℃，进样量为10 μL。流动相梯度为：0～1 min，20%A；1～5 min，80%A；5～12 min，20%A。电离方式为电喷雾电离源(ESI+)；多反应监测模式测量；毛细管电压3.5 kV；毛细管温度为250 ℃；定量模式为选择离子监测模式；脱溶剂气体流量10 L·min-1。测定MC-LR的质谱参数为：母离子为m/z995.70，定量离子为m/z135.0，锥孔电压 50 V,保留时间 0.3 s，碰撞电压 56.45 V。测定MC-RR的质谱参数为：母离子为m/z520.0，定量离子为m/z135.0，锥孔电压 50 V,保留时间 0.3 s，碰撞电压 30.25 V。

1.3 实验方法

1.3.1水样中溶解藻毒素的提取将1 000 mL水样用0.45 μm 的微孔膜过滤，然后分别用10 mL 甲醇和10 mL 水，以5 mL·min-1活化SPE小柱；将水样以4 mL·min-1的流速过柱后，再用5 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脱两次；用氮吹仪将洗脱液浓缩至0.2 mL，并转移到棕色色谱瓶内，置于冰柜内保存，待上机分析。

1.3.2鱼、虾组织中藻毒素的提取(1)提取：将组织切碎，置于冰柜中预冷冻，然后用冻干仪冻干；冻干后的组织用高速粉碎机粉碎。用分析天平称取冻干粉0.5 g 置于 10 mL 塑料(FEP)离心管中，用移液枪向离心管中加入6 mL 体积比为85% 的甲醇水溶液；将离心管置于冰水浴中，用匀浆机匀质5 min；然后将组织匀浆超声 15 min。以8 000 r·min-1的速度在-10 ℃下离心10 min，取上清液至50 mL 离心管中；重复上述85% 甲醇水溶液提取的步骤，合并上清液。(2)除脂：在上清液中加入甲醇饱和的正己烷 10 mL，涡旋30 s，静置3 min，弃去上层(含脂肪的正己烷层)；重复此步骤一次[12]。(3)除蛋白质：将下层清液用氮吹浓缩至 3 mL，向其中加入10 g·L-1的三氯乙酸溶液 1 mL，摇匀后以8 000 r·min-1离心10 min，取上清液用水稀释至 10 mL[12]。(4)固相萃取(SPE)过程：分别用10 mL 甲醇和10 mL 纯水以 5 mL·min-1的流速流过SPE柱，取步骤3得到的10 mL液体上SPE小柱，流速为4 mL·min-1。萃取完毕，用10 mL 5%甲醇水溶液淋洗小柱，流速同上；用氮气吹干SPE小柱 10 min；用5 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脱两次；用氮吹仪将洗脱液浓缩至0.1 mL以下，用甲醇定容至0.2 mL并转移到棕色的色谱进样瓶内，待上机分析。

2 结果与讨论

2.1 提取剂的选择

本实验考察了纯水、50%、75%、85%甲醇水溶液和纯甲醇提取MC-LR和MC-RR的效果(图2a)。结果表明：纯水和50%甲醇水溶液作为提取剂的提取效率低，可能由于藻毒素分子中有较大的疏水性官能团，水的比例太高不利于在含有脂肪成分的组织中提取MCs。当用纯甲醇作为提取剂时，基质中的脂肪等疏水性成分被提取的比例增加，干扰目标物的下一步提取和测定。结果表明，85%甲醇溶液比75%甲醇溶液的提取效果好，检测时的干扰峰比采用纯甲醇时低。

为了获得更高的提取效率，通常需要将生物组织进一步破碎匀浆，并采用超声振荡使MCs能充分析出。但游离的MCs能与样品中的蛋白磷酸酶或谷胱甘肽发生不可逆的反应，过长的样品处理和提取时间反而会导致MCs的提取效率下降。通过对比试验，本实验采用在冰水浴中，将样品用匀浆机匀质5 min，方法为每匀质5 s 后停 5 s，如此反复多次；再超声振荡 15 min，超声过程中每 2 min 涡旋颠倒震荡一次离心管；然后以8 000 r·min-1的速度离心。重复提取2次，合并上清液进行后续处理。

2.2 固相萃取的淋洗

一般采用甲醇水溶液作为MCs固相萃取淋洗剂[9,13]。本实验使用Oasis HLB SPE小柱对提取液进行净化处理。MCs易溶于甲醇，同时，由于MCs 是一种由氨基酸组成的环肽类化合物，因此MCs在水中也有较大的溶解。实验分别选用0%、5%、10%、20%、30%甲醇水溶液作为淋洗液，收集10 mL淋洗液，氮吹后定容至0.2 mL，上机分析。结果表明，随着甲醇比例的增大，杂质去除率上升，但目标化合物的损失迅速提高(图2b)。综合考虑本实验选用5%的甲醇水溶液做淋洗液。

2.3 固相萃取柱上MCs的洗脱

以含0.1%三氟乙酸的甲醇为洗脱液，对洗脱液的用量分别为3、5、8、10、12 mL 时目标物的回收率进行了比较(图2c)。结果表明，随着洗脱液用量的增加，目标物的回收率增加，当洗脱液的用量为8 mL 时，目标物的洗脱率在90%以上，为了保证目标物的洗脱完全，本实验选定洗脱液的用量为10 mL。

2.4 提取液的净化过程对回收率的影响

本实验采用甲醇饱和的正己烷去除脂肪，然后用三氯乙酸去除蛋白质。图2d 显示了鱼肌肉组织提取液去除脂脂肪和蛋白质后的藻毒素加标回收率与未进行这一净化步骤的提取液中藻毒素加标回收率对比。结果表明，净化步骤有利于提高藻毒素的回收率。从另一方面也说明了生物组织中大量的基体成分对藻毒素的测定有影响。

图2 藻毒素的提取条件对其回收率的影响 (a：提取剂对回收率的影响；b：淋洗液对回收率的影响；c：洗脱液体积对回收率的影响；d：净化过程对回收率的影响)Fig.2 The effect of extraction conditions on the recovery rate of MCs(a:extraction solution;b:washing solution;c:eluent volume;c(d):purification step)

2.5 方法学验证

本实验采用一级质谱定性、二级质谱确认定量。结果表明，标准品色谱图同水产样品藻毒素提取纯化液对应的MC-LR和MC-RR在保留时间、准分子离子和碎片离子上有很好的重现性(图3)。

图3 MC-LR 和MC-RR的HPLC-MS/MS谱图Fig.3 HPLC-MS/MS chromatograms of MC-LR and MC-RR a:1 ng·mL-1 MC-LR in mixed standard;b:1 ng·mL-1 MC-RR in mixed standard;c:MC-LR in spiked sample;d:MC-RR in spiked sample;e:MC-LR not found in real sample;f:MC-RR not found in real sample;g:MC-LR found in real sample;h:MC-RR found in real sample.

分别配制浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50、100、250、500 μg·L-1的MC-LR和MC-RR的混合标准系列溶液,各取10 μL 进样，以样品浓度(c)为横坐标，样品峰面积(A)为纵坐标，得到MC-LR和MC-RR的标准曲线。在0.5～500 μg·L-1浓度范围内，MC-LR线性方程为：A=76535.5+5773.5c，R2=0.999；MC-RR线性方程为：A=1.11×106+31535.2c，R2=0.990，均在较宽的浓度范围内呈良好线性关系。

采用在空白样品中逐渐降低加标浓度的方法确定方法的检出限，以3倍信噪比、10倍信噪比分别计算方法的检出限和定量限。MC-LR和MC-RR的检出限(LOD)分别为0.05 μg·L-1和0.08 μg·L-1。以信噪比为10倍时的溶液浓度为定量限，MC-LR和MC-RR定量限(LOQ)分别为0.24 μg·L-1和0.32 μg·L-1，低于世界卫生组织推荐的饮用水MC-LR 限量浓度(1.0 μg·L-1)。

在未检出藻毒素的样品中分别添加不同浓度水平的MC-LR和MC-RR混合标准溶液，按本文藻毒素提取方法处理，分别在两个不同的加标浓度上平行测定7次，计算回收率和相对标准偏差，结果见表1。由表1可知：目标化合物在水中的回收率均不低于88.5%，在生物组织中的回收率在63.8%～85.2%之间，测定值的相对标准偏差(RSD)在5.2%～9.8%之间，符合对痕量污染物的检测要求。

表1 藻毒素的加标回收率(n=7)Table 1 The results of spiked tests(n=7)

2.6 实际样品测定

对湖州某处的淡水养殖池塘，于2015年6月至12月期间取水样过滤后测定，测得其MC-LR含量为0～42 μg·L-1，MC-RR含量为0～12 μg·L-1。某虾塘水中的MC-LR含量为0～117 μg·L-1，MC-RR含量为0～32 μg·L-1。池塘中养殖的花鲢的肝脏组织中检测到MC-LR的最高浓度为2.6 μg·kg-1，虾肉组织中检测到MC-LR的最高浓度为4.2 μg·kg-1，绝大部分鱼、虾样品中未检出游离的藻毒素。

3 结论

建立了SPE分离富集，HPLC-MS/MS法分析水样及鱼、虾体内痕量微囊藻毒素的方法，对藻毒素提取条件进行了优化。该方法灵敏度高、定性和定量可靠，可用于环境水样和生物组织中藻毒素含量的检测。对某淡水养殖池塘的检测结果表明，不同季节的池塘水中游离的藻毒素含量为0～117 μg·L-1，鱼、虾组织样品中为0～4.2 μg·kg-1，绝大部分鱼、虾体内未检测到游离的藻毒素。