固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定方便面 和烤肠中的苯并[a]芘

童 圆， 彭西甜*,， 龚 艳， 韩雅荃， 吕江潮， 冯钰锜

(1.生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学系，湖北武汉 430072；2.湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，湖北武汉 430064；3.长江大学生物工程系，湖北荆州 434020)

苯并[a]芘又称3,4-苯并芘(3,4-Benzopyrene，Bap)，在食品烟熏、烘烤、油炸过程中容易产生[1]。当油温达到270 ℃时，产生的油烟和油炸食品中含有的苯并[a]芘可诱发人体肿瘤和导致细胞染色体的损坏。而苯并[a]芘会在体内蓄积，刚开始接触或吸入苯并[a]芘时没有不适反应，但其有较长的潜伏期，可造成胎儿的畸形和DNA的突变等。苯并[a]芘是目前世界公认的三大强致癌物质之一[2]，因此，许多国家严格限制食品中苯并[a]芘的含量。德国对肉制品中苯并[a]芘的残留限制标准为1 μg/kg，欧盟规定烟熏剂中苯并[a]芘的含量不超过0.03 μg/kg[3]。我国也对苯并[a]芘制定了限量标准，生活饮用水水质标准为0.01 μg/L以下，粮食和肉制品的食品卫生标准为5 μg/kg以下，植物油中为10 μg/kg以下，熏烤动物源性食品为5 μg/kg以下[4]。方便面和烤肠在中国日常消费量很大，2008年韩国电视台报道韩国农心公司生产的6款方便面中检测出苯并[a]芘，因此，建立快速高效的方便面和烤肠中苯并[a]芘的检测方法，对于保障消费者的身体健康和促进相关产业的发展非常重要。

目前，文献报道了大气[5]、肉类食品[6 - 9]、茶叶[10]、水[11]及水产品[12]、植物油[13 - 15]、反应香精[16]、香烟[17 - 19]和土壤[20]中苯并[a]芘的检测方法，主要有荧光分光光度法、薄层层析法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法等[21]。其中，荧光分光光度法容易被其他物质干扰，气相色谱法因其较高的柱温和柱压，引起苯并[a]芘构型变化，为定性和定量带来较大的困难，而高效液相色谱-荧光法具有灵敏度高和分析速度快等优点，是较常用的方法。然而，采用高效液相色谱-荧光法测定苯并[a]芘的国家标准和行业标准方法前处理步骤复杂，有机溶剂消耗较大，不利于批量样品的分析。胡加文等[22]用固相萃取-液相色谱-荧光法测定方便面中苯并[a]芘，得到苯并[a]芘的检出限为0.3 μg/kg，然而该方法中所用淋洗溶剂的体积较大，环境不友好。

本研究采用维泰克科技(武汉)有限公司的苯并[a]芘专用固相萃取柱，结合高效液相色谱-荧光检测，建立了一种食品中苯并[a]芘的快速、高效的分析方法。该方法与传统方法相比，简单快速、有机溶剂消耗少，适于方便面和烤肠等食品中苯并[a]芘的批量分析检测。

1 实验部分

1.1 仪器与色谱条件

LC-20A型高效液相色谱仪(日本,岛津公司)，配荧光检测器。色谱条件：色谱柱：HiSep C18-T色谱柱 (150×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈∶水= 88∶12(V/V)；流量：1.0 mL/min；荧光检测器：λex=384 nm,λem=406 nm；柱温：40 ℃；进样体积：10 μL。IKA MS1 Minishake漩涡振荡器(德国,IKA公司)；Anke TDL-40B型离心机(上海安亭仪器厂)；BSA2202S电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；OA-SYS氮吹仪(美国,Organomation公司)；HiCapt Benzo苯并[a]专用固相萃取柱(500 mg,6 mL)。

1.2 试剂与材料

苯并[a]芘标准溶液(20.0 mg/L)购自农业部环境质量监督检验测试中心(天津)；准确吸取100 μL苯并[a]芘标准溶液，置于10 mL容量瓶中，用正己烷定容，配制成200 μg/L的标准溶液，避光，4 ℃冰箱保存，用于制备标准曲线。色谱纯的丙酮、乙腈、正己烷、异丙醇购自德国默克公司，其它试剂均为分析纯。超纯水由Milli-Q纯水仪(Millipore,Billerica,MA,USA)制备。

不同的方便面和烤肠样品购自武汉市场。

1.3 样品制备

称取2.0 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL正己烷，匀浆3 min，于 6 000 r/min下离心3 min，收集10 mL上清液，待净化。在HiCapt Benzo苯并芘专用柱(500 mg，6 mL)中依次加入5 mL丙酮、2 mL正己烷活化，将10 mL待净化液加入HiCapt Benzo柱中，待上样液完全流出后，用6 mL体积比为1∶4的异丙醇-正己烷混合溶剂清洗固相萃取柱，弃去清洗液，将小柱抽干后，用6.0 mL丙酮将苯并[a]芘从固相萃取柱上解吸下来，收集解吸液，40 ℃氮气吹干，加入1 mL异丙醇涡混定容，0.22 μm滤膜过滤至进样瓶中，待上机分析。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的优化

流动相中乙腈的比例对苯并[a]芘出峰位置有较大影响，乙腈比例较大时，洗脱能力较强，可以缩短苯并[a]芘的保留时间，但是基线漂移较大，且与样品中其它杂质发生重叠；减小乙腈比例，基线相对平稳，可以改善样品溶液中各个色谱峰的分离度，却延长了苯并[a]芘的保留时间，分析操作费时。综合考虑上述因素，当 乙腈∶水=88∶12(V/V)，流速为 1.0 mL/min 时，苯并[a]芘出峰时间合适，基本没有样品基质的干扰，柱压不高且峰形较好。

2.2 样品前处理条件的优化

根据苯并[a]芘易溶于有机溶剂的化学性质，采用正己烷、二氯甲烷及乙酸乙酯作为提取溶剂，结果表明三种提取溶剂对苯并[a]芘都有较高的提取效率。然而，在下一步固相萃取过程中，采用极性较大的二氯甲烷和乙酸乙酯作为上样溶剂时萃取效率分别只有15.5%和13.5%，而置换溶剂会使整个分析过程更加复杂，因此，选择正己烷作为提取溶剂。

方便面和烤肠中基质较为复杂，一些干扰物也可能被萃取到HiCapt Benzo柱上，因此在解吸前选择合适的清洗溶剂对其进行清洗，可以减少干扰物对目标分析物分离检测的影响。清洗溶剂的选择应该遵循在除去干扰物的同时保证目标物的回收率最高的原则。在正己烷中加入不同比例的异丙醇作为清洗溶剂，结果表明6 mL体积比为1∶4的异丙醇-正己烷混合溶剂作为清洗溶剂，苯并[a]芘回收率较好，同时也可以去除大部分的基质组分。

最后，实验考察了甲醇、乙腈和丙酮对苯并[a]芘的解吸效率，发现6 mL的丙酮基本可以完全解吸HiCapt Benzo柱上的苯并[a]芘，而甲醇和乙腈的解吸效率都在70%以下，因此选择6 mL的丙酮作为解吸溶剂。

在最优化的实验条件下，苯并[a]芘标准样品色谱图、方便面和烤肠空白样品色谱图和加标样品色谱图分别见图1及图2。从图中可以看出，经过HiCapt Benzo柱处理后，方便面和烤肠提取液可以得到很好地净化，苯并[a]芘的分析没有基质的干扰。

图1 5.0 μg/L苯并[a]芘标准溶液(a)、空白方便面样品(b)以及加标5.0 μg/kg的苯并[a]芘的空白方便面样品(c)的色谱图Fig.1 Chromatograms of benzo[a]pyrene standard solution(a),blank instant noodles(b) and blank instant noodles spiked with benzo[a]pyrene at 5.0 μg/kg spiked level(c)

图2 5.0 μg/L苯并[a]芘标准溶液(a)、空白烤肠样品(b)以及加标5.0 μg/kg的苯并[a]芘的空白烤肠样品(c)的色谱图Fig.2 Chromatograms of benzo[a]pyrene standard solution(a),blank instant noodles(b) and blank instant noodles spiked with benzo[a]pyrene at 5.0 μg/kg spiked level(c)

2.3 方法学考察

2.3.1线性方程及检出限将200 μg/L的苯并[a]芘标准溶液用异丙醇稀释，配制质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的系列标准溶液，从低浓度到高浓度进样，按最优的色谱条件进行测定，每个浓度进行三次平行测定，得出峰面积的平均值，以峰面积(X)为横坐标，质量浓度(Y，μg/mL) 为纵坐标，制作标准曲线，其回归方程为：Y=8.0×10-6X+0.1062，相关系数R2=0.9997。分别以3倍和10倍的信噪比(S/N)计算方法的检出限和定量限，检出限和定量限分别为0.13 μg/kg和0.40 μg/kg。我国规定苯并[a]芘在粮食和肉制品中的最大残留限量为5 μg/kg，该方法的灵敏度可以很好地满足苯并[a]芘分析检测的要求。

2.3.2回收率和精密度准确称取 2.0 g空白的方便面和烤肠样品，分别加入1.0、5.0、10.0 μg/kg的苯并[a]芘，按照1.3的方法进行提取净化，最优的色谱条件进行测定，计算加标回收率，分析结果见表1。结果显示，方便面和烤肠中苯并[a]芘低、中、高三种加标浓度的回收率分别在 92.2%～98.3%和95.9%～97.9%之间，日内和日间相对标准偏差(RSD)分别在 3.34%～5.01%和2.11%～4.07%之间，表明该方法的准确度和精密度良好，能够满足方便面和烤肠中苯并[a]芘日常检测的要求。

表1 方便面和烤肠中苯并[a]芘分析的低中高添加回收率和日内、日间精密度Table 1 Recoveries at three different concentrations and intra-and inter-day precision for analysis of benzo[a]pyrene in instant noodles and sausage

2.4 实际样品的测定

在市场上分别购买了10种不同品牌的方便面和烤肠样品，在优化的条件下采用本方法对这些样品中的苯并[a]芘进行分析，在所有样品中均未检出苯并[a]芘残留。对其中三种方便面和三种烤肠样品进行了添加回收率的考察，结果如表2所示，所有样品的回收率在83.4%～105.6%之间，RSD小于7.0%，表明该方法具有很好的适用性，在实际样品分析中具有很好的应用前景。

表2 实际样品分析的添加回收率及相对标准偏差Table 2 Recoveries and RSDs for the analysis of benzo[a]pyrene in real samples

3 结论

本文建立了一种固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定方便面和烤肠中苯并[a]芘含量的方法。样品用正己烷提取后，采用苯并[a]芘专用固相萃取柱净化富集，高效液相色谱荧光分析，回收率及精密度均获得满意的结果，同时将其应用到实际样品的分析，取得了较好的效果。与传统苯并[a]芘检测方法相比，该方法大大缩短了检测时间和有机溶剂的消耗量，提高了检测效率，很适合用于油炸烟熏食品中苯并[a]芘的批量快速分析。