土壤中砷形态分析研究进展

秦玉燕, 王运儒, 时鹏涛， 杜国冬*， 蓝 唯， 农耀京

(1.广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西南宁 530001； 2.农业部亚热带果品蔬菜质量监督检验测试中心，广西南宁 530001)

1 前言

砷是土壤中普遍存在的有毒类金属元素，被国际癌症研究机构(IARC)列为第Ⅰ类明确致癌物。砷在地壳中主要以硫化物形式存在，世界上土壤砷背景平均值为6 mg/kg，我国为11.2 mg/kg[1]。由于采矿、冶炼、皮革、化工、化石燃料燃烧等工业活动的加强和含砷的农药、化肥、杀虫剂的大量使用，使得大量砷进入土壤。因此，土壤砷污染目前已经成为一个全球性的环境问题[2]。

砷在土壤中以不同形态存在，且不同形态间的毒性差异较大，总砷含量不足以评价砷对环境的影响及生物有效性。同时，砷的形态决定了砷在土壤中的可移动性和迁移转化规律，也决定了生物对其吸收利用的程度[3]。土壤砷污染严重影响动植物生长和品质[4]，并通过食物链进入人体，最终威胁人类的生存和健康。砷的形态分析有可能阐明砷进入环境的方式及迁移、转化过程的本质，阐明砷在水、气、土壤、植物循环中的地球化学行为，为环境健康风险评估、砷污染土壤诊断与修复提供重要的科学依据，同时也为提高农产品质量和更好地制定土壤和农产品质量标准提供理论基础。

2 土壤中砷的形态

砷在自然界中以-Ⅲ、0、+Ⅲ、+V四种价态存在，形成各种砷化合物，通常称为氧化还原态。目前发现的砷形态共有50多种，包括砷酸(As(Ⅴ))、亚砷酸(As(Ⅲ))、一甲基砷酸(MMA(Ⅴ))、二甲基砷酸(DMA(Ⅴ))、三甲胂氧化物(TMAO)、四甲基砷(Me4As+)、砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)、阿散酸(p-ASA) 和洛克沙胂(ROX)等。土壤中砷主要以无机形态As(Ⅴ)和As(Ⅲ)为主[5]，还含有少量的有机砷。土壤中砷形态与吸附介质的种类、pH、氧化还原电位及土壤微生物活动[6]等有关，在氧化条件下以As(Ⅴ)为主，还原条件下以As(Ⅲ)为主，As(Ⅲ)可移动性比As(Ⅴ)大[7]。砷的氧化还原态决定着砷化合物的毒性，其中无机砷的毒性较强，As(Ⅲ)毒性是As(Ⅴ)的60倍，DMA(Ⅴ)和MMA(Ⅴ)毒性较弱。近年来在有机砷代谢过程发现的中间体DMA(Ⅲ)和MMA(Ⅲ)的毒性与As(Ⅲ)相当，AsB和AsC基本被认为无毒[8]。另一方面，由于砷在土壤中通常与Al、Fe、Ca等矿物元素相结合，根据结合的紧密程度将砷分为不同的结合形态，如交换态、碳酸盐态、铁锰氧化物态、有机结合态、残渣态等，通常称为砷的赋存形态。砷的赋存形态对于了解砷在土壤中的迁移转化规律及生物有效性具有重要意义。

3 联用技术分析法

3.1 样品前处理技术

联用技术一般是色谱法与光谱、质谱法联合应用的分析方法，但分析前需要对样品进行前处理。前处理过程的提取方式有水浴提取、振荡提取、超声辅助提取和微波辅助提取等。水浴提取一般伴随加热，加热可提高提取率，但高温易使砷形态发生转化。振荡提取对砷形态影响小，但提取率较低。超声辅助提取和微波辅助提取的应用较多[9]。超声过程可将固体颗粒打碎，增加溶剂与颗粒的接触面积，使不易溶解的物质分散到提取剂中，也使包裹在颗粒内部的物质溶出。微波提取中提取剂和目标成分可在微波作用下迅速“体加热”，采用低功率的微波萃取可避免长时间高温分解样品。张静[10]以1.0 mol/L磷酸为提取剂，发现100 ℃水浴提取3 h，提取率可达79%，而超声萃取只有51%。可见加热相比超声能提供更大的能量以满足砷从土壤矿物晶格中释放。不同提取方法及应用见表1。

表1 土壤中砷形态提取方法Table 1 Extraction methods of arsenic speciation in soil

前处理过程既要使不同砷形态尽可能全部提取出来，又要保持其原有形态不发生变化，提取剂的选择是关键。提取剂的种类、pH值和温度是砷形态发生转变的主要影响因素[27]。目前国内外应用最多的提取剂为磷酸及磷酸盐溶液，其化学性质同砷酸盐相似，不仅可以溶解土壤表面吸附的砷，还可以通过配位交换和竞争吸附解吸出氧化铁和氧化铝吸附的砷，甚至土壤颗粒晶格中的砷。前处理过程最大的难点是As(Ⅲ)易氧化成As(Ⅴ)，加入一定的辅助剂如抗坏血酸可以减少As(Ⅲ)的氧化，提高其稳定性。白云飞[28]分别优化了磷酸、盐酸、磷酸盐、草酸铵四种溶剂超声提取土壤底泥中砷形态的方法，结果表明0.6 mol/L 磷酸的提取效果最好，提取率为49.46%。同时比较了抗坏血酸、EDTA和氯化羟铵三种辅助提取剂的效果，发现加入0.1 mol/L抗坏血酸时回收率在85.0%～105.0%之间，达到最佳。刘崴等[29]比较了磷酸-抗坏血酸、磷酸盐-NaDDC两种组合提取剂对土壤砷形态的提取效果，发现磷酸-抗坏血酸的提取率比较高，为70%以上；磷酸盐-NaDDC提取率在57%以下，但提取过程砷形态稳定性比较好，回收率在81.4%～115.9%之间。Georgiadis等[30]以磷酸盐为提取剂，研究了EDTA、盐酸羟铵和NaDDC 三种辅助剂对As(Ⅲ)氧化成As(Ⅴ)的抑制效果，发现加入EDTA不能阻止As(Ⅲ)的氧化；加入1%盐酸羟铵，提取时间超过12 h时，As(Ⅲ)开始氧化；加入0.5% NaDDC能显著抑制As(Ⅲ)的氧化。其原理是NaDDC作为一种螯合剂，在提取过程可以与As(Ⅲ)形成螯合物，阻止其氧化。Gallardo等[24]认为As(Ⅲ)氧化成As(Ⅴ)是动力学控制过程，其氧化速率取决于反应液浓度和pH，当对提取液进行稀释和调节pH为中性时，反应速率很低。他以3 mol/L磷酸提取土壤样品，提出控制As(Ⅲ)氧化的两种方法：一种是提取液离心后立即稀释10倍，5 h内As(Ⅲ)不会氧化；另一种是提取后立即用氨水调节pH为中性，As(Ⅲ)在5 h内保持稳定。

3.2 分离及检测方法

3.2.1气相色谱联用法气相色谱气相色谱(GC)用于易形成挥发性成分的低沸点物质的分析，对不易挥发的组分分析前需进行衍生化处理。巯基乙酸甲酯(TGM)可作为砷化物衍生试剂，但TGM属于强还原剂，会将As(Ⅴ)还原成As(Ⅲ)，所以一般用于有机砷的衍生，不适用于土壤样品的分析。由于很难找到一种有效的GC衍生法，使各砷形态同时被衍生成低沸点化合物，但GC与MS、ICP-MS等的连用可用于直接分析挥发性砷的形态。Yuan等[31]建立了一种液氮冷阱捕集、在线收集和分离湖泊沉积物释放出的挥发性砷的方法，用棉花填装柱对四种挥发性砷形态AsH3、CH3AsH2、(CH3)2AsH和(CH3)3As进行富集和分离，GC-AFS分析时检出限达2.5～11 pg，RSD为3.2%～4.9%。周黎明等[32]采用正丁硫醇衍生-GC-MS对化学武器污染的土壤中的砷形态进行了研究，表明东北某地被污染的土壤中砷化合物的形态主要为 2-氯乙烯胂酸、双(2-氯乙烯基)胂酸、三(2-氯乙烯基)胂、三苯胂、苯胂酸和二苯胂酸等。

3.2.2毛细管电泳联用法毛细管电泳(CE)具有高效、快速、样品用量少的特点，不同砷形态只要有结构或电荷上的差别都可以进行分离。但在实际样品的分析过程中，CE与检测设备联用的接口较为复杂，紫外检测器的灵敏度较低，对样品基质的耐受力弱等问题限制了CE联用技术的发展。CE-ICP-MS一般只能用于标准溶液和基体简单样品的分析。Koellensperger等[33]对接口处进行了改进，将CE-ICP-MS联用技术应用于蜈蚣草根际土壤的分析，在分析As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsC、AsB 6种标准溶液时，检出限为5.26～12.1 ng/g，RSD为3.73%～6.65%。李平静等[34]采用在柱富集-CE/UV联用技术对4-羟基苯砷酸、洛克沙砷、苯砷酸、4-氨基苯砷酸和4-硝基苯砷酸进行分析，检出限为0.68～6.9 μg/L，RSD为5.6%～11.8%。

3.2.3高效液相色谱联用法高效液相色谱(HPLC)分离主要包括离子对色谱和离子交换色谱。离子对色谱适用于分离中性和离子态的砷，四丁基氢氧化铵(TEAH)通常作为离子对试剂。当流动相pH为5.0～7.0时，As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)能较好分离，并依次洗脱出来，但As(Ⅲ)和AsB会同时最先洗脱出来。若调pH=9.0，As(Ⅲ)带负电，色谱柱上较弱保留；AsB为两性离子，色谱柱上不保留，二者可进行分离[35]。用氧化剂将As(Ⅲ)氧化成As(Ⅴ)也可实现AsB和As(Ⅲ) 的分离[36]。以苯-1,2-二磺酸二钾盐作为离子对试剂的多级色谱分析法，已成功用于分离常见的8种砷形态[20]。离子交换色谱在土壤砷形态分析中应用最广，阴离子交换色谱一般用于分离As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA；阳离子交换色谱一般分离AsB、AsC、TMAO、Me4As+。Mrquez-García等[37]用Hamilton PRP-X100阴离子交换柱分离As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA和三种砷糖，Zorbax SCX-300阳离子交换柱分离AsB、AsC、TMAO和一种砷糖，从土壤中分离检测到11种砷化合物。HPLC可以和大多数检测系统如AAS、AFS、ICP-AES、ICP-MS等直接联用，也可以通过氢化物发生(HG)装置再与这些检测器联用。

(1)HPLC-ICP-MS。HPLC-ICP-MS联用具有超高灵敏度、多元素同测等优点，是实验室研究砷形态最有效的工具之一。Mestrot等[38]建立了一种基于硝酸银浸渍的硅胶填充管的化学捕集法，富集稻田土壤中的挥发性砷，HPLC-ICP-MS检测AsH3、CH3AsH2、(CH3)2AsH和(CH3)3As四种形态，检出限达3.8 ng，回收率80.1%～95.6%，可用于野外研究。Mello等[39]用HPLC-ICP-MS分析了金矿矿区富砷土壤在厌氧条件下的砷形态变化过程，并意外发现部分样品主要含有机砷，可能是土壤中的生物(如海藻和蓝藻)将无机砷转化为有机态砷。Dobran等[40]用HPLC-ICP-MS分析了土壤中有机物的含量对土壤砷形态的影响，发现有机物含量在7.5%～15%之间时，土壤结合的As(Ⅴ)会逐渐转变为As(Ⅲ)。HPLC-ICP-MS在土壤砷形态分析中的应用见表2。

表2 HPLC-ICP-MS联用技术的应用Table 2 Application of HPLC-ICP-MS

(2)HPLC-HG-AFS。HG是在酸性条件下用还原剂KBH4将砷还原成相应的氢化物然后进行检测。HG使砷形成的氢化物与复杂样品基质分离[43]，只有形成的氢化物才能进入检测器，消除了检测器内遇到的光谱和化学干扰，灵敏度比常规的液体进样方式提高10～100倍。对于不能形成氢化物的有机砷形态如AsB、AsC、Me4As+、砷糖和芳香族砷化物等，可通过微波辅助氧化、紫外光氧化等技术将其转化为能形成氢化物的形态[35]。HPLC-HG-AFS在土壤砷形态分析中的应用见表3。

表3 HPLC-HG-AFS联用技术的应用Table 3 Application of HPLC-HG-AFS

(3)HPLC与有机质谱联用法。近年来，越来越多新的砷糖和砷脂类化合物逐渐被发现，由于常规检测方法无法提供化合物结构信息，色谱分离过程可能出现同时洗脱或者不完全洗脱等原因[44]，新化合物的定性和定量分析较为困难。采用HPLC与电喷雾质谱(ESI-MS)[45]、快原子轰击串联质谱(FAB)、多级串联质谱等有机质谱联用分析，可提供未知砷化物的结构信息，用于新的、未知结构的砷形态的鉴定[46]。Hsieh等[47]用IC-ESI-MS联用法对海藻中几种未知形态的砷糖和砷脂类化合物进行了定性分析。

4 分级提取法

分级提取法是一种基于操作定义的选择性提取法，通过一系列化学活性不断增强的试剂来依次提取土壤中不同形态的砷，然后用测定总砷的方法分别测定各形态含量。Tessier等人在1979年首先提出五步提取法，将土壤中的砷形态分为交换态、碳酸盐态、铁锰氧化物态、有机结合态和残渣态。Beesley等[48]在该方法基础上进行了修正，将土壤中的砷形态分为水溶态、表面吸附态、Fe -Al 结合态、碳酸盐结合态和残渣态，并被胡毅鸿等[49]应用于分析石门雄黄矿矿区土壤砷形态。由于不同学者使用方法不同，各方法流程差异较大，得出的数据缺乏可比性。欧共体标准物质局于90年代初提出了三步提取法，对各步骤和流程做了统一规范，将土壤中的砷形态分为可交换态、可还原态、可氧化态和残渣态，简称BCR法，并研制出了沉积物标准物质BCR 601。之后有学者针对BCR法重现性差的问题进行了改进[50]。胡德新等[51]采用改进BCR法测得矿产品堆场土壤可交换态、可还原态、可氧化态和残渣态砷所占比例分别为1.4%～1.7%、1.6%～2.2%、19.4%～28.2%、64.4%～75.6%。BCR法是对重金属形态分析普遍适用的方法，但相比之下Tessier法及各种改进方法在土壤砷形态分析中的应用更广。Ariza等[52]分别比较了Tessier修正法、Meguellati法和BCR法三种方法对不同类型土壤的砷形态分析，发现修正Tessier法更适合分析富含铁氧化物的土壤。许仙菊等[53]采用Tessier连续提取法测得水稻不同生育期土壤砷均以残渣态为主，占90%以上，其次是铁锰氧化物态(0.8%～6.9%)，有机结合态(0.2%～0.9%)、碳酸盐态(0.2%～1.3%)和交换态(0～0.4%)。杨晓伟[54]采用修正的Tessier法测得内蒙古某矿区土壤中水溶态砷、交换态砷、铝形砷、铁形砷、钙形砷和残渣态砷的含量分别为0.27%、1.56%、7.17%、12.47%、15.74%和62.79%。

水溶态和可交换态砷易迁移，是土壤中毒性最强的砷形态，易被植物吸收，其含量可反映植物受损程度[55]；碳酸盐态、铁锰氧化物态和有机结合态不易被植物吸收，但在一定条件下可释放出来；残渣态一般处于原生矿物晶格中，较为稳定。土壤中砷形态一般以残渣态为主，水溶态和交换态砷含量很低，说明土壤中大部分砷能稳定存在，在自然条件下较难释放到环境中，对环境相对安全。分析土壤不同结合态的砷，有利于人们在了解土壤砷形态组成的基础上，对土壤砷污染进行修复。研究表明含铁材料如FeCl3、FeCl2、Fe和Fe2O3[56]和有机无机复合药剂[57]可将土壤中部分易溶态砷转化成难溶态砷，生物炭可以通过吸附作用对污染土壤中可溶态砷进行固定[58]。在微生物作用下，土壤中加入有机物将有利于土壤中砷的甲基化作用和不同砷形态转化为挥发态砷的过程，这预示着土壤砷污染修复的另一种新方式[59]。

5 同步辐射X-射线吸收光谱法

同步辐射X-射线吸收光谱法(Synchrotron Radiation X-ray Adsorption Spectroscopy,SRXAS)是一种原位微观分析技术，包括拓展X-射线精细结构(EXAFS)和近边结构分析(XANES)。EXAFS可提供元素氧化还原态、键合方式、分子形态等信息，XANES可得到混合物中不同形态的组成比例。SRXAS法对气、液、固三相样品均可实现元素氧化还原状态的原位探测，同时可提供表面结合态、晶格态和无定形沉淀等形态信息[60]，在分子水平上给出目标元素周围的局部结构和化学信息，实现形态分析与结构鉴定的同步进行。

SRXAS法无需进行样品预处理，避免了前处理过程砷形态的转变，近年来在土壤砷形态分析的应用越来越多[61]。刘永轩[62]用EXAFS测定了广西刁江流域的表层土壤，结果上游土壤中砷形态主要由毒砂、As(Ⅴ)和As(Ⅲ)组成，百分含量分别为15%、82%、3%；中游土壤砷形态由毒砂和As(Ⅴ)组成，分别为8%和92%；下游土壤砷形态主要由As(Ⅴ)组成。万小铭等[63]通过SRXAS法研究不同种群蜈蚣草中砷形态差异，结果表明，在蜈蚣草根部，砷以与O结合的方式存在，还存在少量As-S配位，砷形态以As(Ⅴ) 为主，占59.6%～83.8%。Manning等[64]用XANES技术分析发现，As(Ⅲ)处理的土壤中，As(Ⅲ) 主要与Fe(Ⅲ)的氢氧化物结合，而As(Ⅴ)可与Fe(Ⅲ)的氢氧化物、铝的氢氧化物和铝硅酸盐结合。Acosta等[65]采用XANES分析矿山附近植物根际土壤中的砷形态，结果显示所有样品中的砷均为As(Ⅴ)。Landrot等[66]用EXAFS分析污染土壤中的砷形态，结果显示土壤中的砷主要与Al结合，其次与Fe结合，并且主要以As(Ⅴ)形式与铝氧化物结合，形成类似于砷铝石结构的化合物。

SRXAS法可应用于检测样品处理过程砷形态是否发生变化，协助优化联用技术中的样品前处理方法。Huynh等[67]用薄膜扩散梯度技术富集砷，1 mol/L HNO3或1 mol/L NaOH溶液将富集的砷反萃入溶液中，再进行HPLC-ICP-MS或HPLC-HG-AFS分析砷形态；对样品处理全过程采用XANES技术分析砷形态的变化，发现砷形态在富集过程都是稳定的，但被反萃入溶液后发生了变化，部分As(Ⅴ)转变成As(Ⅲ)，DMA转变成MMA，因此，需要对反萃取过程的条件进行改进。Xu等[68]采用XANES分析土壤在厌氧条件下砷形态的变化规律，结果显示厌氧条件下土壤溶液中的砷主要以As(Ⅲ)存在，随着厌氧时间的增加，溶解砷的浓度呈现出M型变化特性，即加入硫酸盐后，砷的浓度在厌氧时间为24 h和240 h时最高。近年来，有学者将SRXAS法和分级提取法联合应用于土壤样品的分析。Kim等[69]将土壤样品先进行分级提取分析，残渣再进行SRXAS分析，结果显示冶金和尾矿污染的土壤中砷主要与铁氧化物和硫化物结合。Niazi等[70]采用分级提取法和SRXAS技术分析污染土壤中砷的形态和有效性，两种方法分析结果均显示土壤中砷主要以铁氧化物结合态存在，且大部分样品中砷为As(Ⅴ)，只有少数样品为As(Ⅲ)。将分级提取法和SRXAS技术相结合，既可以对砷的不同价态及与矿物结合的不同形式进行分析，又可以对不同形态进行准确定量，是土壤砷形态分析发展的方向。

6 结语与展望

联用分析法和分级提取法属于表观形态研究方法，可实现对砷形态的间接分析；SRXAS是一种微观分析技术，可对砷形态进行直接分析。目前实验室主流的分析方法是联用技术分析法，其中应用最广的是HPLC-ICP-MS和HPLC-HG-AFS联用法，具有较高的灵敏度。由于土壤基质较复杂，联用技术的前处理过程如何保持砷形态的稳定性一直是分析的难点，提取率高且不改变砷形态的前处理方法还有待于进一步研究。分级提取法的优点在于对仪器设备要求低，不受条件限制，但只能对土壤砷的赋存形态进行分析，且受土壤理化和生物因素影响大，重复性较差，因此主要应用于土壤砷的生物有效性分析。SRXAS法可同时分析砷的赋存形态和氧化还原态，无需对样品进行预分离或化学处理，分析结果更可靠，但对仪器设备和操作人员的技术要求较高，一般实验室还不具备分析条件。SRXAS法在研究元素吸附机理，元素形态转化机理、规律和影响因素等方面具有独特的优势，是最具发展前景的形态分析方法。另外，将联用技术分析法、分级提取法和SRXAS法相结合是今后发展的趋势。