基于氨基功能化石墨烯磁性材料的磁固相萃取-高效 液相色谱法分析海水中的氯酚类污染物

孙美娜， 刘佰威， 项 奇， 王春春， 毛时强， 沈昊宇*， 叶仙森

(1.浙江大学宁波理工学院，浙江宁波 315100； 2.浙江杭康检测技术有限公司,浙江杭州 310011； 3.国家海洋局宁波海洋环境监测中心站，浙江宁波 315012)

氯酚类(CPs)污染物广泛存在于环境中，其中2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、五氯酚都具有较高的毒性,已被美国环保局列入优先控制污染物名单[1]。海洋环境中残留的痕量酚类环境污染物属于溶解有机物。溶解有机物在海水中的含量虽低，但它和海水的物理性质和化学性质却有很大的关系，且对海洋生物的生长和繁殖有重要的作用。随着人们对海洋环境保护意识的加强，海洋环境中残留痕量酚类污染物的检测与防治已成为重点研究方向之一[2]。虽然近年来经过研究者们的努力，已经建立了气相色谱法[3 - 4]、液相色谱法[5 - 6]和毛细管电泳法[7]等CPs化合物的检测方法。然而，海水基体复杂，CPs化合物含量处于痕量水平[8]，往往需要富集后才能准确测定。新近发展起来的以磁性复合材料为富集材料，建立的磁固相萃取(MSPE)技术进行样品预处理，可以克服现有的样品富集方法存在吸附容量小、富集能力差、不易实现固液分离等不足，并且在外磁场作用下可以实现快速、有效固液分离，已经成为国内外研究的重要方向之一[9 - 10]。

石墨烯基材料作为一种新型材料，其巨大的应用潜力在材料、环境等众多领域引起了重视和研究[11]。尤其是近年发展起来的石墨烯基磁性材料综合了石墨烯的高吸附性能和磁性材料易分离的特性，在化学污染物的分离与富集方面有广泛的应用前景[12]。本文采用氨基功能化石墨烯磁性材料为富集材料，建立了一种磁固相萃取-高效液相色谱(MSPE-HPLC)法分离检测海水中的痕量氯酚。将磁性纳米Fe3O4引入石墨烯材料，并进行功能化修饰，可以对CPs化合物进行高选择性识别和富集，富集后的复合材料在外加磁场作用下可实现快速磁分离。研究表明该方法具有快速、高效、灵敏、环境友好等优点。

1 材料与方法

1.1 仪器与工作条件

大连伊利特液相色谱仪，液相色谱分析条件：采用伊利特 C8反相液相色谱柱(250×4.6 mm i.d.,5 μm)分离，以体积比为70∶30的甲醇-5 mmol/L NH4Ac水溶液为流动相，流速1 mL/min，进样量20 μL，用UV230Ⅱ紫外检测器在230 nm检测。Bruker D8 Advance X-射线衍射仪；日立H-7650透射电子显微镜(TEM)和Lake Shore 7410振动样品磁强计用于材料的表征。

1.2 试剂

4-氯酚(4-CP)、2,4-二氯酚(2,4-DCP)、2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)、2,3,4,6-四氯苯酚(2,3,4,6-TeCP)、五氯苯酚(PCP)(分析纯，阿拉丁试剂有限公司)。分别准确称取0.05 g各CPs化合物，然后溶于100 mL甲醇中，配制成500 mg/L的储备液；工作液采用移取一定体积的储备液用模拟海水稀释定容，当天配制。二乙烯苯(DVB)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)(分析纯，Fluke试剂有限公司)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(TCI Tokyo化学工业有限公司)；四乙烯五胺(TEPA)、FeCl3·7H2O、乙二醇(EG)、聚乙二醇400(PEG400)、NaAc、2,2′-偶氮双(异丁腈)(ABIN)(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；氧化石墨烯(GO)(先丰纳米材料科技有限公司)；甲醇(色谱纯，Merck试剂有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1模拟样品制备模拟海水样品按照文献方法[13]配制，组成如表1所示。

表1 模拟海水样品组成Table 1 Component of synthesized sea water

1.3.2氨基功能化石墨烯磁性材料合成氨基功能化石墨烯磁性材料(NH2-MGO)按照改进的文献方法[14]合成。其制备过程如下：先采用溶剂热法制备磁性纳米Fe3O4，进一步通过沉淀聚合法得到环氧基功能化的Fe3O4-高分子材料(Fe3O4@P(GMA-co-DVB))；GO经酰胺化活化，进一步通过TEPA与Fe3O4@-P(GMA-co-DVB)开环键合得到氨基功能化石墨烯磁性材料(NH2-MGO)。

1.3.3磁固相萃取(MSPE)实验过程移取50.00 mL经0.45 μm微孔滤膜真空过滤后的海水样品，置于150 mL平底烧瓶中，加入20 mg NH2-MGO，温度308 K下恒温振荡10 min，磁分离，弃除上层溶液。然后加入1 mL 1%NaOH的甲醇溶液振荡4 min进行脱附，磁分离，吸取上层清液，氮吹至干，以200 μL 5%HCl-甲醇溶液溶解，过0.2 μm滤膜，在伊利特液相色谱仪上进样分析。

图1 NH2-MGO的透射电镜(TEM)图Fig.1 TEM image of NH2-MGO

2 结果与讨论

2.1 氨基功能化石墨烯磁性材料(NH2-MGO)的表征

图1为NH2-MGO的透射电子显微镜(TEM)图。由图1可知，NH2-MGO中磁性高分子为典型的核壳结构，平均粒径约为800 nm。深色部分为Fe3O4磁核，平均粒径约为200 nm；浅灰色部分为高分子层，均匀分布在磁核外层，厚度约为300 nm；磁性高分子与氧化石墨烯之间通过共价键实现交联。

图2为NH2-MGO的磁滞回线(MHL)。从图2可以看出，NH2-MGO的饱和磁化强度约为45.6 emu/g，磁响应良好，能够在磁场下实现良好的分离。

图3为NH2-MGO的X-射线衍射(XRD)图。由图可知，NH2-MGO出现了Fe3O4的6个典型的2θ角位于30.1°、35.5°、43.1°、53.4°、57.0°和62.6°的吸收峰，分别对应于Fe3O4在(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)的吸收，说明NH2-MGO保持了Fe3O4的尖晶石构型。

图2 NH2-MGO的磁滞回线Fig.2 Magnetic hysteresis loop of NH2-MGO

图3 NH2-MGO的X-射线衍射(XRD)图Fig.3 XRD of NH2-MGO

2.2 富集条件的优化

2.2.2吸附时间的优化考察了吸附时间对5种CPs吸附性能的影响。配制5种CPs浓度为2.0 μg/L的混合溶液，加入NH2-MGO 20 mg， 温度308 K下恒温振荡，分别控制吸附时间为1～20 min，吸附结束后，磁分离，分析上清液中CPs的含量，结果如图5所示。由图可知，随着吸附时间的延长，5种CPs的吸附率逐渐增大，当吸附时间为8 min后，吸附率达到最大，进一步增加吸附时间，吸附率基本上保持不变。因此，将10 min作为5种CPs的最优吸附时间，用于下一步的实验。

图4 溶液pH值对NH2-MGO吸附CPs的影响Fig.4 Effects of the pH values on the adsorption properties of NH2-MGO to CPs

图5 吸附时间对CPs萃取效率的影响Fig.5 Effect of the extraction time on the extraction efficiency to CPs

2.2.3脱附溶液的选择分别选择甲醇、2%氨水甲醇溶液、1%NaOH的甲醇溶液作为5种CPs的脱附溶液，控制溶液体积为1 mL，恒温振荡20 min，结果如图6所示。由图可知，当甲醇作为脱附溶液时，2,4,6-TCP、2,3,4,6-TeCP和PCP的回收率可达80%以上，而另外2种CPs的回收率较低(<80%)。可能的原因是：2,4,6-TCP、2,3,4,6-TeCP和PCP苯环上的取代基团较多，酚羟基较难与NH2-MGO之间形成氢键作用力，而主要通过π-π相互作用力与石墨烯相结合，甲醇就能将其破坏，所以三者的脱附率较高；相反地4-CP和2,4-DCP与吸附剂氨基之间存在氢键作用力，甲醇难以将其破坏，所以回收率较低。当采用2%氨水甲醇溶液作为脱附溶液时，2,4-DCP的回收率有了明显的提高，可能的原因是碱性条件不利于氢键的形成，但4-CP的回收率(73.2%)并没有因为氨水的加入而得以显著改善，可能是因为4-CP的沸点相对较低，在脱附溶液氮吹挥干过程中4-CP有所损失，所以脱附回收率较低。为此，实验采用1%NaOH的甲醇溶液，将4-CP转化成钠盐，减小挥干过程中的损失，从而提高脱附回收率。结果显示，当1%NaOH甲醇溶液作为脱附溶液时，4-CP的脱附回收率较为理想(>95%)，而其余4种氯酚的回收率也较高。因此，后续的实验选择1%NaOH的甲醇溶液作5种CPs的脱附剂。

2.2.4脱附剂体积和脱附时间的优化分别以0.5、1、2、3 mL的1%NaOH的甲醇溶液为脱附剂，考察了脱附剂体积对CPs回收率的影响(图7)，结果表明，当选择脱附剂的体积≥1 mL时，5种CPs的回收率均可以高于90%，且随着脱附剂体积的增加，回收率无明显增加；而增加脱附剂的体积，不仅溶剂用量增加，且后续氮吹的时间也较长，因此，选择1 mL 1%NaOH的甲醇溶液为脱附剂较为合理。

图6 脱附溶液的影响Fig.6 Effect of the desorption solvent on the desorption efficiency to CPs

图7 脱附溶液体积的影响Fig.7 Effect of the usage amount of desorption solvent on the desorption efficiency to CPs

图8 脱附时间的影响Fig.8 Effect of the desorption time on the desorption efficiency to CPs

图8表明，随着脱附时间的延长，5种CPs的脱附率逐渐增大，2,4,6-TCP、2,3,4,6-TeCP和PCP的最大脱附率所需的时间为2 min，4-CP和2,4-DCP的最大脱附率所需时间为4 min。综合考虑，选择4 min作为5种CPs的脱附时间。

2.3 方法的检出限、定量限、回收率和精密度

5种CPs在浓度为1～500 ng/L的范围内与峰强度呈现良好的线性关系，线性相关系数(R2)均大于0.9994，见表2。以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)分别作为检出限(LOD)和定量限(LOQ)，结果表明：5种CPs的检出限分别为0.18～1.20 ng/L，定量限为0.6～4.0 ng/L。

表2 5种CPs的回归方程、线性范围、检出限(LODs)和定量限(LOQs)Table 2 Regression equation,linear range,LODs and LOQs of the five CPs

以不含待测物的模拟海水样品为空白，分别加入5种CPs进行低、中、高三个浓度水平的回收实验(表3)。5种CPs在三个水平的加标回收率分别为92.6%～98.2%、93.2%～99.5%和92.8%～101.2%，日内精密度(RSD)为0.6%～6.8%，日间RSD(7 d)为1.0%～7.2%。

表3 5种CPs在模拟海水样品中的回收率和精密度(RSD)(n=5)Table 3 Precision and accuracy of the five CPs in synthesized sea water samples(n=5)

图9 海水空白样品(a)、实际样品(b)和5种CPs的加标样品(加标2 μg/L)采用MSPE法富集前(c)和富集后(d)的色谱图Fig.9 Chromatograms of the blank(a),real seawater sample(b) and spiked sample(2 μg/L) before(c) and after(d) MSPE enrichment

2.4 实际样品分析与文献方法比较

采用所建立的方法对宁波沿海海域的5个实际海水样品中的CPs进行了检测，发现其中的1种样品中含有2,4,6-TCP，浓度为6.5 ng/L。图9为海水空白样品(未检出CPs样品，曲线a)、实际样品(曲线b)和加标样品采用MSPE法富集前(曲线c)和富集后(曲线d)的HPLC图谱，可见本文所建MSPE法可以有效去除海水中基体干扰，达到富集CPs的目的。将本文所建立的方法与文献方法[15-25]进行比较，本文所建立的MSPE-HPLC方法具有操作简单、检出限低等优点。

3 结论

本文建立了磁固相萃取-高效液相色谱(MSPE-HPLC)法检测海水中的5种CPs残留量的分析方法。样品经氨基功能化石墨烯磁性材料(NH2-MGO)富集、磁固相萃取，通过磁分离，HPLC法检测。结果表明，以NH2-MGO为海水中5种CPs的富集材料，海水样品无需调节pH值，前处理快速简便，无需特别装置，试剂用量少，对环境污染小，可以实现5种CPs化合物的同时测定。