固相萃取-超高效液相色谱/串联质谱法检测人体血清中 邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯代谢物

肖永华*， 李静娜， 何振宇， 黄常刚， 梁高道

(武汉市疾病预防控制中心，湖北武汉 430022)

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)是一种邻苯二甲酸酯类化合物，其作为增塑剂主要应用于PVC产品、塑溶胶、聚乙烯地板、食品包装以及PVC材质的医疗器材中[1]。DEHP在体内水解产物为邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)，而MEHP可被进一步被代谢转化为5HO-MEHP、5OXO-MEHP等含脂肪侧链的氧化物[2]。DEHP经口摄入进入肠道后，多数DEHP能在24 h内完全代谢，仅有低于10%的原药随着尿液排出，其余均转化为代谢物后随着尿液、粪便等排出[3]。动物实验研究结果显示， DEHP 暴露显著抑制了青春期雌、雄仔鼠的活动性，并且显示出性别特异性[4]；DEHP及其代谢物具有生殖毒性，能导致雄性大鼠睾丸损伤并诱发睾丸间质细胞肿瘤[5]。

目前对人体内DEHP及其代谢物的研究相对较少，所采集的人群生物样本主要是尿液[6 - 7]，对DEHP代谢物的检测手段主要包括液相色谱-质谱联用法[8]、气相色谱-质谱联用法[9]、液相色谱法等[10 - 11]。本文在前期他人研究的基础之上，选择更能代表人群内暴露的血清样品作为监测对象，采用超高效液相色谱/串联质谱法检测DEHP代谢物。该方法快速，定性定量能力强，能保证检测数据的准确可靠。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

UPLC-TQD超高效液相色谱/串联质谱仪(美国，Waters公司)，配备电喷雾离子源(ESI)以及Masslynx4.1数据处理系统；AL204电子天平(瑞士，Mettler Toledo公司)。

标准品：邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)、单(2-乙基-5-羟基己基)邻苯二甲酸酯(5HO-MEHP)、单(2-乙基-5-氧己基)邻苯二甲酸酯(5OXO-MEHP)、以及内标：13C4邻苯二甲酸单乙基己基酯(13C4MEHP)，均购自美国AccuStandard公司。β-葡萄糖醛苷酶(美国Sigma公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国天地公司)；乙酸钠、氢氧化钠、乙酸铵(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；高氯酸(优级纯，天津市东方化工厂)；氨水(分析纯，开封东大化工有限公司试剂厂)；MAX固相萃取小柱(200 mg/6mL，美国Waters公司)。实验用水为Milli-Q纯水机(MILLIPORE公司)制备。

1.2 样品处理

称取1.00 g血清样品于15 mL离心管中，加入5.0 mL浓度为0.2 mol/L的乙酸钠溶液以及100 μL 100 ng/mL的13C4MEHP内标工作液，充分混匀，再加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶，混匀后于37 ℃酶解提取12 h。将提取液恢复至室温后在提取液中加入200 μL高氯酸，充分涡旋后再用10 mol/L氢氧化钠溶液调节至沉淀消失。

将MAX固相萃取小柱分别用5 mL甲醇和5 mL纯水活化后，将提取液过柱，用水将MAX小柱淋洗至中性后再用5 mL甲醇淋洗，最后用5 mL 5%甲酸甲醇洗脱小柱，洗脱液经氮气吹干后用200 μL纯水复溶，高速离心后用超高效液相色谱/串联质谱仪进行分析。

1.3 仪器条件

1.3.1色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC®HSS T3柱(100×2.1 mm,1.8 μm)；流动相：5 mmol/L乙酸铵溶液(A)，甲醇(B)。梯度洗脱程序：0～2.1 min，70%A；2.1～3.0 min，70%～20%A；3.0～5.0 min，20%A；5.0～6.1 min，20%～70%A。流速：0.2 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。

1.3.2质谱条件电喷雾离子源(ESI)，负离子模式；毛细管电压：-2.3 kV；脱溶剂气温度：350 ℃；离子源温度：120 ℃；扫描模式：多反应监测(MRM)。采用质谱直接进样的方式优化MEHP、5HO-MEHP、5OXO-MEHP以及13C4MEHP质谱采集参数， MRM采集参数详见表1。

表1 MEHP、5HO-MEHP、5OXO-MEHP以及13C4MEHP的MRM参数Table 1 The MRM parameters for MEHP,5HO-MEHP,5OXO-MEHP and 13C4MEHP

*quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法

样品处理时所采用较多的分别为酶解[8]、乙腈沉淀蛋白等方法进行提取。采用乙腈沉淀蛋白后高速离心，将上清液直接进行分析发现几种代谢物的回收率均较低，由此可推断在进行蛋白沉淀时，DEHP代谢物被沉淀所吸附；同时在采取酶解法提取DEHP代谢物时，当血清样品被酶解过夜，加入高氯酸沉淀蛋白后，离心取上清液过MAX小柱净化，也发现几种代谢物的回收率均较低，尤其是作为内标的13C4MEHP 几乎全部损失。通过进一步的研究发现，当采用酶解法提取目标物时，用高氯酸沉淀蛋白后再用10 mol/L氢氧化钠溶液调节至沉淀消失，这时提取液的pH值呈碱性，代谢物在乙酸钠溶液中以离子状态存在，将提取液过MAX小柱时，代谢物都会被吸附在小柱之上，先用水将小柱淋洗至中性后再加入3 mL 甲醇淋洗，最后用3mL 5%甲酸甲醇洗脱，最终的检测结果发现MEHP等几种代谢物的回收率达到了89.6%～103.2%。同时，也将酶解提取液不沉淀蛋白直接过MAX小柱，结果存在提取液过小柱困难的情况最终也导致绝对回收率偏低，因而最终选择将酶解液用高氯酸沉淀蛋白再将10 mol/L氢氧化钠溶液调节至沉淀消失这一种处理方法来处理血清样品。

2.2 色谱及质谱条件优化

实验分别对色谱及质谱条件进行优化，其优化后的条件见1.3节。MRM色谱图详见图1和图2。

图1 MEHP、13C4MEHP、5HO-MEHP和5OXO-MEHP的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of MEHP，13C4MEHP,5HO-MEHP and 5OXO-MEHP

图2 血清加标样品MEHP、13C4MEHP、5HO-MEHP和5OXO-MEHP的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms ofserum spiked with MEHP，13C4MEHP,5HO-MEHP and 5OXO-MEHP

2.3 线性范围、回收率、精密度及检出限

MEHP、5HO-MEHP、5OXO-MEHP在1.00～100.0 μg/L范围内线性关系良好，相关系数均在0.995以上。在血清样品中添加浓度为100 μg/kg的MEHP、5HO-MEHP、5OXO-MEHP混合标准，内标13C4MEHP的添加浓度均为10 μg/kg，分别做6个加标平行样和2个血清本底，平均回收率为89.6%～103.2%。回收试验结果见表2。通过逐级稀释法来确立本方法的检出限，当进样浓度为0.1 μg/L的MEHP、5HO-MEHP、5OXO-MEHP时，信噪比均大于3，经回收率校正后，选择0.1 μg/kg作为本方法MEHP、5HO-MEHP、5OXO-MEHP的检出限。

表2 MEHP、5HO-MEHP、5OXO-MEHP的线性范围、回归方程、相关系数及回收率(n=6)Table 2 Linear ranges,regression equation,correlation coefficients,recoveries and RSDs of MEHP,5HO-MEHP,and 5OXO-MEHP(n=6)

3 结论

人群在日常的工作和生活中很容易暴露于邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)，而DEHP及其代谢物对人群健康的影响也需引起更多人的重视。本文采用固相萃取-超高效液相色谱/串联质谱法检测人体血清中邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)代谢物，方法灵敏度高，定性能力强，能为人群的DEHP内暴露情况提供重要的技术支持。