基于硫化镍的C-反应蛋白免疫传感器的研制

张坤蕾， 李 瑶， 白茹燕， 张 茜， 李德蕾， 胡 蓉， 杨云慧

(云南师范大学化学化工学院，云南昆明 650500)

C-反应蛋白(C-Reactive Protein,CRP)是机体组织感染、炎症及受损引起变化而刺激肝细胞合成的急性相反应蛋白，为炎症的一种敏感性指标[1]。CRP正常情况下以微量形式存在于血浆中。当机体有炎症及创伤时，该蛋白含量会明显升高[2]。近年来研究发现，血浆中CRP是动脉粥样硬化的重要介质[3]，也是心血管疾病的有效预测因素[4]。同时，血清中CRP的含量是监控早期心脏受损的一项重要指标，是最新发现的冠心病相关炎症因子，在冠心病的诊断过程中发挥着重要的作用。目前，临床上诊断血清中CRP常用的方法有比浊法[5]和免疫浊度法[6]，以及酶联免疫吸附、化学发光、荧光等方法[7]。这些方法虽然特异性强，但存在如设备昂贵、操作过程繁琐、检测时间长及样品消耗量大等缺点，且容易产生假阴性结果。因此，发展快速检测CRP的方法具有重要意义。电化学免疫传感器将免疫分析技术与电化学传感器相结合，具有成本低、灵敏度高和检测快速方便等优点，受到研究者普遍关注。

NiS由于具有特殊的光学、磁学以及催化性质而成为一类重要的半导体纳米材料。当温度超过其临界温度时，NiS会产生磁性和导电性能的转变[8 - 9]，在光电导材料和锂电池阴极材料等方面都有着广泛的应用[10]。目前，已合成多种形貌的NiS纳米材料，如纳米晶、纳米棒、三角状纳米棱柱、薄膜以及空心球等[11 - 13]。金纳米颗粒(Au NPs)表面活性位点多、吸附力强且非特异性吸附作用小，因此它能与多种生物大分子结合且不影响其生物活性。NiS纳米粒子与Au NPs可形成金硫键，起到固定Au NPs的作用，而Au NPs可吸附抗体，从而增加抗体的固定量，并且能增强膜与基体电极结合的牢固程度。具有响应时间短、使用寿命长、灵敏度高、稳定性好等优点[14]。

本实验以负载Au NPs的NiS为固定基底，将CRP抗体固定于玻碳电极(GCE)上，通过二茂铁甲酸标记CRP抗体，构建夹心型CRP生物传感器，实现对CRP的定量检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

CHI660D电化学工作站(上海辰华仪器公司)；采用三电极体系：修饰电极或GCE为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极。ME104E电子分析天平(瑞士,METTLER TOLEDO公司)。

C-反应蛋白抗体(anti-CRP)、抗原(CRP)购于上海领潮生物科技有限公司；壳聚糖(CHIT)、牛血清白蛋白(BSA)、磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.4)，均购于美国Sigma公司；NiCl2·6H2O购于国药集团化学试剂有限公司；无水NaAc、硫代乙酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)购于麦克林试剂网；尿素购于美国Amresco公司；乙二醇、无水乙醇、柠檬酸三钠均购于天津市风船化学试剂科技有限公司；二茂铁甲酸购于北京百灵威科技有限公司；氯金酸购于昆明铂锐金属有限公司。所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验过程

1.2.1材料的制备球形NiS的制备参考文献方法[15]：将0.474 g NiCl2·6H2O、1.44 g无水NaAc以及0.15 g硫代乙酰胺依次溶解在20 mL乙二醇中。将此溶液装入高压釜中，140 ℃保持8 h。反应结束后，产物经离心分离、乙醇洗涤、干燥，得到的黑色固体即为球状NiS。

Au NPs参考Frens的方法[16]制备：将50 mL水和500 μL 1%氯金酸溶液装入圆底烧瓶中，加热搅拌至沸腾，迅速加入1.75 mL 1%的柠檬酸三钠溶液，继续加热直至溶液变为酒红色。

1.2.2二茂铁甲酸标记anti-CRP将6.0 mg二茂铁甲酸溶解于1 mL PBS中，调节pH至7.3，再加入11 mg NHS和EDC，振摇1 h，离心，弃去上层清液。沉淀用PBS洗涤两次后，分散于1 mL PBS中，逐滴加入10 μL 1 mg/mL anti-CRP，振摇一夜，于8 000 r/min下离心，即得二茂铁甲酸标记anti-CRP。分散于1 mL PBS中，于冰箱中4 ℃保存，备用。

图1 免疫传感器制备流程Fig.1 Flowchart of the immunosensor

1.2.3anti-CRP免疫传感器的制备将直径为3 mm 的GCE在砂纸上打磨，在麂皮上用不同粒径的Al2O3粉末抛光成镜面后，依次用HNO3(1+1)、乙醇、水各超声洗涤5 min，晾干。取10 μL 0.5%CHIT滴加到GCE表面，自然晾干。再滴加10 μL NiS溶液，晾干后滴加10 μL Au NPs，晾干，最后滴加CRP抗体，4 ℃过夜干燥。将修饰好的电极用PBS清洗，自然晾干后，用1%BSA于37 ℃下恒温1 h，以封闭电极表面的非特异性结合位点。将不同浓度的CRP抗原滴加于免疫传感器上，再于37 ℃恒温培育40 min，用PBS冲洗。然后滴加10 μL的二茂铁甲酸标记的CRP抗体，恒温培育50 min。免疫传感器制备流程如图1所示。

1.2.4检测方法在10 mL 0.1 mol/L PBS中，以该传感器为工作电极，在 0.1～0.5 V范围内，采用差分脉冲伏安法(DPV)测定。测量条件：振幅50 mV，脉冲宽度0.05 s，脉冲周期0.1 s。根据该传感器在0.3 V左右的电流值与样品中CRP浓度成正比的关系，实现对CRP的定量测定。

2 结果与讨论

2.1 材料的表征

对所合成的NiS进行X-射线粉末衍射(XRD)分析，结果见图2。从图可看出，谱峰分别出现在2θ为30.1°、34.6°、45.8°、53.6°和65.5°左右，与文献报道[15]对应一致，表明产物为NiS。

取少量NiS超声分散在无水乙醇中，用透射电镜(TEM)观察其形貌(图3)，可知所制备的NiS形貌呈类球形，粒径约200～300 nm。

2.2 免疫传感器的电化学行为

图4为Labeled anti-CRP/CRP/anti-CRP/Au/NiS/CHIT/GCE在10 mL 0.01 mol/L PBS (pH=7.4)中的循环伏安图。可以看出，当扫描速度在20～100 mV/s 变化时，峰电流的绝对值与扫描速度的平方根成正比，ipc=-11.17+2.49v1/2；ipa=5.73-1.81v1/2，说明该电流受扩散速度控制。

图5为不同电极在5 mmoL/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的交流阻抗(EIS)曲线。曲线a为裸GCE的交流阻抗，曲线b为滴加了CHIT的GCE交流阻抗，曲线c为固定NiS之后GCE的交流阻抗，Au/NiS/CHIT/GCE的交流阻抗为曲线d。由图5可知，滴加CRP抗体之后由于抗体阻碍了电子在电极表面的传递，使阻抗增加(曲线e);当用1%BSA封闭后滴加CRP抗原，由于抗原抗体结合形成了蛋白质复合物进一步阻碍了电子在电极表面的传递(曲线f)；滴加二茂铁甲酸标记抗体之后，抗原和标记抗体结合形成了复合物使阻抗进一步增加(曲线g)。

图2 NiS的X-射线衍射(XRD)图Fig.2 XRD of NiS

图3 NiS的透射电镜(TEM)图Fig.3 TEM image of NiS

图4 免疫传感器于不同扫速条件下的循环伏安图(内置图为峰电流对扫描速率平方根的线性图)Fig.4 Cyclic voltammograms of the labeled anti-CRP/CRP/anti-CRP/Au/NiS/CHIT/GCE at various scan rates(Inset:the plot of peak current vs v1/2) a:20 mV/s,b:40 mV/s,c:60 mV/s,d:80 mV/s,e:100 mV/s.

图5 不同电极在5 mmoL/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的交流阻抗谱图Fig.5 Nyquist plots of impedance spectra by using different electrodes in 5 mmoL/L [Fe(CN)6]3-/4- solution(a):bare GCE;(b):CHIT/GCE;(c):NiS/CHIT/GCE;(d):Au/NiS/CHIT/GCE;(e):anti-CRP/Au/NiS/CHIT/GCE;(f):CRP/anti-CRP/Au/NiS/CHIT/GCE;(g):Labeled anti-CRP/CRP/anti-CRP/Au/NiS/CHIT/GCE.

2.3 实验条件的优化

2.3.1溶液pH对免疫传感器的影响溶液pH值不仅影响抗原、抗体的活性，还影响蛋白质在电极表面的亲和性。考察了溶液的pH值对DPV峰电流的响应情况，结果如图6所示。由图可知，在pH为7.3时，峰电流信号最大，实验选择的最佳pH值为7.3。

2.3.2固定抗体浓度对免疫传感器的影响实验考察了固定抗体浓度对免疫传感器的影响。由图7可知，当培育的CRP抗原浓度保持在20 ng/mL时，逐步增加固定抗体浓度，电极响应电流增大，当抗体浓度为40 μg/mL时传感器的响应电流最大，当固定抗体浓度大于40 μg/mL时，传感器的响应电流有所下降。实验选择40 μg/mL作为最佳固定抗体浓度。

图6 pH值对免疫传感器响应性能的影响Fig.6 Effect of pH on the response of immunosensor

图7 固定抗体浓度对免疫传感器的影响Fig.7 Effect of immobilized anti-CRP concentration on the response of immunosensor

2.3.3抗原培育时间对传感器电流的影响在37 ℃的培育条件下，当固定抗体浓度为40 μg/mL而抗原浓度为20 ng/mL时，通过DPV法分别测定不同抗原培育时间下的免疫传感器的响应电流，结果表明响应电流随着时间的增大，先增加后减小。当培育时间为40 min时，响应电流最大，因此，选择40 min为最佳抗原培育时间。

2.3.4标记抗体培育时间对免疫传感器的影响固定抗原浓度、抗体浓度和抗原培育时间不变，通过DPV法分别测定不同标记抗体培育时间(10～60 min)对免疫传感器响应电流的影响。结果表明，随着标记抗体培育时间的增加，电流逐渐增大。当标记抗体培育时间为50 min时，传感器响应电流最大。因此，选择50 min作为最佳标记抗体培育时间。

2.4 CRP免疫传感器的响应性能

在优化实验条件下，测得传感器对不同浓度CRP响应的工作曲线，如图8所示。传感器在0.01～500 ng/mL范围内具有良好的线性响应，线性方程为：I=0.0224c+1.4515，相关系数R2=0.9939，CRP的检测限为3.3 pg/mL。该结果比Kokkinos等[17]报道的检测限低。

2.5 免疫传感器的选择性

选择性是考察传感器生物分子识别特异性的有利判据。本实验考察了CRP传感器的选择性。在最优条件下，考察了4种可能的干扰物对传感器的影响。分别将40 ng/mL CEA、40 ng/mL谷氨酸(Glu)、40 ng/mL甘氨酸(Gly)、1%的BSA等干扰物质与20 ng/mL的CRP抗原按体积比1∶1混合，进行干扰试验。结果如图9所示，几种条件下电流值基本相同，说明这几种干扰物不影响传感器的测定，由此可看出此传感器具有良好的选择性。

图8 免疫传感器的校正曲线(内置图为免疫传感器对不同浓度CRP的DPV响应)Fig.8 The calibration curve of immunosensor(Inset:The DPV response of immunosensor to different concentration of CRP) a-i:500,450,360,260,160,100,50,1,0.01 ng/mL,respectively.

图9 免疫传感器的选择性Fig.9 The selectivity of the electrochemical immunosensors

2.6 回收率的测定

采用标准加入法，在稀释的血清中加入3种不用浓度的CRP抗原，每个浓度平行测量3次，结果见表1。检测平均回收率为98.1%，说明该传感器可以用于实际样品中CRP含量的检测。

表1 CRP回收率的测定(n=3)Table 1 The recovery of immunosensor(n=3)

2.7 传感器的再生

测定完毕，用0.01 moL/L PBS 洗涤传感器，然后放在4.0 moL/L的尿素溶液中搅拌洗脱30 min，使免疫复合物解离，从而使电极得到再生。

2.8 传感器的重现性及稳定性

同一传感器平行测定3次，相对标准偏差为2.41%，说明传感器具有较好的重现性。将该传感器放置一周后测定，电流为原来的97.02%。放置36 d后电流保持原来的 84.7%，表明该传感器具有较好的稳定性。

3 结论

本实验利用NiS与Au NPs将CRP抗体固定于玻碳电极上，通过二茂铁甲酸标记CRP抗体，构建夹心型CRP生物传感器实现对抗原的定量检测。该传感器具有较宽的线性范围，较低的检测限，为CRP的检测提供了一种新的技术。