极谱法检测水体中的孔雀石绿

王 铒， 陈 文， 吉 喆， 周 源

(成都理工大学材料与化学化工学院，四川成都 610059)

孔雀石绿(MG)是一种三苯甲烷类杀菌剂，它具有高效且价格低廉的优势,故曾在水产养殖业中得到广泛的应用。近年研究发现，孔雀石绿类化合物及其代谢产物均具有高残留及高毒性,可产生致癌、致畸、致突变等副作用[1]。但由于孔雀石绿抗菌效果好、价格低廉、在水产养殖中仍有违规使用的情况，严重影响了我国在国际水产品市场上的竞争力和声誉。因此，出于对人们健康的考虑，以及对水产品质量的监督，建立一个快速测定水体中孔雀石绿的分析方法具有重要的现实意义。

国内目前较常见的孔雀石绿检测方法有高效液相色谱法[2 - 3]、高效液相色谱-串联质谱法[4]、拉曼光谱法[5]、光谱法[6 - 8]等。这些方法均有较好灵敏度和较低的检出限，但所需仪器设备较昂贵，检测时间较长，对检测人员的综合水平要求较高。而电化学分析方法以其仪器简单、灵敏度高、操作便捷等优势得到了广泛的应用。目前文献报道的孔雀石绿的电化学检测方法不多[9 - 10]，且大多采用修饰电极法进行检测，而极谱方法检测未见报道。

鉴于极谱法有着固体电极所不能比拟的较宽的电势窗口，优良的稳定性和灵敏度，而其它固体电极不经修饰较难准确检测孔雀石绿，本研究建立了检测孔雀石绿的极谱分析新方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

JP-303极谱仪(成都仪器厂)，三电极体系：滴汞电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂微电极为辅助电极；恒温水浴锅(金坛市金城国际实验仪器厂)；电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

荧光素标准溶液(1.0×10-3mol/L)：准确称取0.0332 g荧光素于烧杯中，加入0.1 mol/L NaOH溶液1.0 mL，加入少量蒸馏水，搅拌使其完全溶解后，转移至100 mL容量瓶中用蒸馏水定容。孔雀石绿标准储备液(0.1 g/L)：准确称取孔雀石绿0.0100 g，加0.5 mL乙腈溶解，用蒸馏水定容于100 mL容量瓶中。孔雀石绿标准溶液(1.0 mg/L)：准确移取1.0 mL孔雀石绿标准储备液于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容。B-R缓冲溶液[11](取质量分数为85%的正磷酸2.71 mL、冰乙酸2.36 mL，加硼酸2.47 g，用蒸馏水稀释至1 L，三者浓度均为0.04 mol/L ，用0.1 mol/L NaOH溶液调节酸度)、乙酸-乙酸钠缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、磷酸缓冲溶液，pH均为7.0。实验所用试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

1.2 实验方法

在25 mL的比色管中，准确加入0.3 mL 1.0×10-3mol/L荧光素溶液，再依次准确加入一系列孔雀石绿标准溶液，或适量的样品溶液和9.0 mL B-R缓冲溶液(pH=7.0)，用蒸馏水稀释至25 mL，摇匀，静止反应15 min后，取适量倒入10 mL小烧杯中，在起始电位为-0.40 V(vs.SCE)，静止时间10 s，扫描速率600 mV/s，扫描次数4次，量程0～6.0×103nA的仪器条件下，于室温下进行测定，记录其二阶导数波峰的峰电流值。

2 结果与讨论

2.1 底液的选择

2.1.1缓冲溶液的种类本实验分别考察了pH=7.0的磷酸缓冲溶液、HAc-NaAc缓冲溶液、B-R缓冲溶液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液四种缓冲溶液对体系的影响，缓冲溶液用量均为2.0 mL，结果表明在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，峰电流值最大，且随着孔雀石绿的加入，峰电流有稳定的下降趋势，但在该缓冲溶液中，体系极谱峰不稳定。在磷酸缓冲溶液中，峰电流值也较大，但是峰电流的变化无规律。而在B-R缓冲体系中，峰电流值较大，峰形稳定，而在高、低浓度的孔雀石绿中，峰电流下降稳定。最终选取的缓冲溶液为B-R缓冲溶液。

图1 缓冲溶液pH对峰电流的影响Fig.1 Effect of buffer acidity on the peak current cSF:1.2×10-5 mol/L;v:600 mV/s.

2.1.2缓冲溶液的pH按照实验方法，分别配制0 μg/L、20 μg/L(低)和60 μg/L(高)三个浓度的孔雀石绿标准溶液，分别加入不同pH的B-R缓冲溶液，考察该缓冲溶液pH对峰电流的影响。由图1可知，缓冲溶液的pH对高、低浓度及不加孔雀石绿的溶液的影响趋势大致相同，均在pH=4.5～6.0时体系峰电流较高且较平稳。在pH=6.0～7.0时体系峰电流迅速下降，而在pH=8.0～10.0时，还原峰消失。故只有在中性的条件下，荧光素与B-R发生络合，且随着孔雀石绿的加入，对其络合还原性产物的生成有抑制作用。从图中可看出，在pH=7.0时候，随着孔雀石绿浓度的增加，峰电流稳定下降，且在极谱测定中，体系的还原峰最稳定平滑。浓度越高，峰电流越低，抑制作用越强。因而最终选择B-R缓冲溶液的pH为7.0。

2.1.3缓冲溶液的用量按照实验方法，分别配制20 μg/L(低)、60 μg/L(高)两个浓度的孔雀石绿标准溶液，分别加入不同体积的B-R缓冲溶液(pH=7.0)，考察该缓冲溶液用量对峰电流的影响。结果表明，缓冲溶液的用量对高、低浓度孔雀石绿溶液影响趋势相同，缓冲溶液加入量在2.0～4.0 mL时，峰电流均稳定上升；缓冲溶液用量在6.0～11.0 mL时，峰电流均稳定。在缓冲溶液用量为9.0 mL时，高、低浓度的孔雀石绿溶液峰电流达到最大值，且与空白值之间差值最大。故选择缓冲溶液最佳用量为9.0 mL。

2.2 荧光素浓度的影响

按照实验方法，配制20 μg/L(低)、60 μg/L(高)两个浓度的孔雀石绿标准溶液，再分别加入浓度为0.6×10-3、0.8×10-3、1.0×10-3、1.2×10-3、1.4×10-3、1.6×10-3mol/L的荧光素溶液，考察荧光素浓度对峰电流的影响。从0.6×10-3mol/L到1.0×10-3mol/L峰电流一直增大，而1.0×10-3mol/L之后随浓度的增大峰电流反而减小，且高、低浓度的孔雀石绿标准溶液峰电流差值最大。因此实验中选择1.0×10-3mol/L荧光素溶液进行实验。

2.3 仪器条件的优化

按照实验方法，在相同的底液条件下，分别配制20 μg/L(低)、60 μg/L(高)两个浓度的孔雀石绿标准溶液，利用单因素变量法研究得到最佳仪器条件为：扫描速率为600 mV/s，静置时间为10 s，起始电位为-0.40 V，汞柱高度为40 cm。

2.4 温度及稳定性实验

考察了温度从0～45 ℃条件下对峰电流影响，得出温度在25～30 ℃的范围内，有稳定且较大的峰电流，故在此温度范围进行测定最佳。在敞开和密闭条件下进行稳定性实验，得到在敞开体系中低浓度较稳定，但高浓度在100 min之后峰电流值不稳定。所以测试样敞开时在1 h之内测定最好；在密闭环境中对其48 h的变化，从数据可以看出在5～14 h内由于昼夜温差的影响造成电流的变化较大。所以控制在室温条件下24 h内进行实验。

2.5 标准曲线和精密度

2.6 共存离子的影响

按照实验方法配制浓度为40 μg/L的孔雀石绿溶液，考察水体中常见的阴、阳离子对测定的干扰情况，在允许误差为±5%和±10%的范围内，确定共存离子的干扰倍数[12]。从表2可以看出，常见的K+、Na+、Cu2+及阴离子对测定的干扰较小，而Fe3+、Mg2+、Ca2+、Ni2+等的干扰较大。在自来水中以上干扰较大离子的浓度达不到产生干扰的量。但在鱼塘中，Fe3+、Mg2+、Ca2+等的浓度则较大，因此在测定前需进行样品前处理。本实验采用沉淀掩蔽和络合掩蔽的方法对样品进行前处理。

表1 共存物质的干扰Table 1 The interference of coexistent ions

2.7 极谱机理分析

2.7.1极谱机理按照实验方法，分别配制荧光素溶液、B-R缓冲溶液、B-R缓冲溶液+荧光素和B-R缓冲溶液+荧光素+孔雀石绿4组溶液，在-400～-1 200 mV范围内扫描各溶液的极谱波，结果见图2。由图可知：B-R缓冲溶液和荧光素在扫描范围内均没有还原峰出现，而当荧光素和B-R溶液混合时，在-870 mV(vs.SCE)左右产生一个灵敏的还原峰，因此可以推测荧光素在B-R缓冲溶液中，因酸度适宜而在滴汞电极上产生了还原反应。当其中加入孔雀石绿时，荧光素的峰电流下降，推断是由于孔雀石绿对荧光素的还原峰有抑制作用，推断该抑制作用是它们结合生成了非电化学活性的络合物，从而降低了溶液中荧光素的浓度所致。下降的程度和孔雀石绿的浓度具有显著的相关性，以此作为间接测定孔雀石绿含量的依据。在已确定的最佳底液条件，配制浓度为40 μg/L孔雀石绿溶液，得到循环伏安图只有还原峰而没有氧化峰出现，说明该还原过程不可逆。

2.7.2紫外-可见光谱分析对不同溶液体系进行紫外-可见光谱扫描，由图3可知B-R缓冲溶液(曲线b)在360～550 nm范围内没有特征吸收峰(吸收值为0与X轴重合)，荧光素溶液(曲线a)在490 nm处有一个特征吸收峰，曲线c在490 nm处的吸收值较曲线a的吸收值低，说明荧光素在B-R缓冲溶液中因酸效应的缘故，其溶液中的形态有所改变。而加入孔雀石绿后(曲线d)，原孔雀石绿(曲线g)在619 nm的特征峰消失，同时使490 nm处的荧光素的吸光度值大幅下降。推断孔雀石绿与荧光素形成了新的络合物从而使荧光素吸收值大幅的减小。曲线e(虚线)是在SF和B-R缓冲溶液中加入掩蔽剂后在490 nm处的吸收值。可以看出与不加掩蔽剂的溶液的吸光度值差异不大，而曲线f和曲线d几乎重合，因此可知掩蔽剂对体系几乎没影响。

2.7.3电化学行为研究按照实验方法，分别配制A溶液(不含MG)和B溶液(含40.0 μg/L MG)，在扫描速率为300～800 mV/s，其他条件不变的情况下，分别测定并记录两溶液的峰电流和峰电位。在此扫

图2 不同体系的极谱曲线Fig.2 Polarographic curves of different systems a:SF(1.2×10-5 mol/L)；b:B-R buffer solution；c:SF(1.2×10-5 mol/L)+B-R buffer solution;d:SF(1.2×10-5 mol/L)+B-R buffer solution+MG(40.0 μg/L).

图3 不同体系的紫外-可见吸收光谱图Fig.3 UV-Vis absorption spectra of different systems a：SF(1.2×10-5 mol/L)；b：B-R buffer solution；c：SF(1.2×10-5 mol/L)+B-R buffer solution；d：c+MG(40 μg/L)；e：c+EDTA(2.5 g/L)；f：d+EDTA(2.5g/L)；g：MG(40 μg/L)+B-R buffer solution.

速范围内，峰电流与扫描速率呈正比，其线性回归方程分别为：Ip″(×103nA)=0.0011v(mV/s)+0.7355(R2=0.9952)；Ip″(×103nA)=0.0012v(mV/s)+0.5901(R2=0.9872)。峰电流和峰电位均与扫描速率呈线性关系，且Ip″随着扫速v的增加而增加。考察了扫描速率与峰电位的关系，表明扫速在300～800 mV/s 的范围内，Ep随v的增大而负移，且Ep与lnv呈线性关系，其线性回归方程分别为：Ep(V)=-30.316lnv-0.66(R2=0.9764);Ep(V)=-28.732lnv-0.67，(R2=0.9901)。

当电化学过程为受吸附控制的完全不可逆过程时，根据公式[13]：

(1)

式中，E0′(V)为标准电极电位，ks为表面反应标准速率常数，α是电子转移系数，n是电子转移数。

2.8 环境水样分析

取三个用蒸馏水洗净的塑料瓶，在两处鱼塘及成都理工大学砚湖中心处，将瓶子深入水下50 cm左右[14]，打开瓶盖，装满水后在水下盖上瓶盖后取出，分别标注为鱼塘P1、鱼塘P2和砚湖水样。过滤，静置。常温密闭条件下20 h后测定。将3个水样均用0.45 μm滤膜过滤于烧杯中，各取20 mL，均加入2.0 mL 1.2 mol/L的NaOH溶液和EDTA溶液，摇匀后静置5 min，再分别用滤膜进行过滤，将溶液用HCl调节至中性。

分别取0.3 mL荧光素标准溶液和9.0 mL B-R缓冲溶液于25 mL比色光管中，再分别加入1.0 mL经过处理的鱼塘P1、鱼塘P2和砚湖水样，用蒸馏水稀释至25 mL，静置15 min，在最佳仪器条件下测定，结果见表2。孔雀石绿回收率在90.45%～105.60%之间，方法可用于测定水样中孔雀石的含量。

表2 加标回收实验(n=3)Table 2 The recovery experiment(n=3)

ND:not detecteld.

3 结论

本文建立了一种简单的、间接检测环境水样中孔雀石绿的极谱方法，方法线性范围20.0～100.0 μg/L，相关系数r=0.9962。电化学行为研究表明：孔雀石绿与荧光素结合生成了非电化学活性的络合物，降低了溶液中荧光素的浓度，该电极反应物是荧光素，其极谱波为不可逆还原吸附波。该方法的加标回收率在90.5%～105.6%之间，表明方法满足分析要求，可用于环境水样中孔雀石绿的检测。