苯那普利对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA、NOX4表达的影响

赵燕云，项协隆，简怡娟，董飞侠，3

（1.浙江中医药大学附属温州中医院 药剂科，浙江 温州 325000；2.浙江中医药大学附属温州中医院肾内科，浙江 温州 325000；3.温州老年病医院 肾内科，浙江 温州 325000）

苯那普利对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA、NOX4表达的影响

赵燕云1，项协隆2，简怡娟2，董飞侠2，3

（1.浙江中医药大学附属温州中医院 药剂科，浙江 温州 325000；2.浙江中医药大学附属温州中医院肾内科，浙江 温州 325000；3.温州老年病医院 肾内科，浙江 温州 325000）

目的：观察苯那普利对单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β1、α-SMA、NOX4表达的影响，探讨苯那普利对肾间质纤维化的作用机制。方法：将54只SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组、苯那普利组，每组18只。苯那普利组予1.6 mg/kg苯那普利灌胃给药，每天1次，模型组、假手术组予10 mL/kg 0.9%氯化钠溶液灌胃，每天1次。模型组和苯那普利组大鼠均结扎左侧输尿管制备单侧输尿管梗阻肾纤维化模型。各组分别于造模第7、第14、第21天随机处死6只大鼠，取左侧肾脏组织做病理检测，Masson法观察肾纤维化程度，免疫组织化学染色检测肾组织TGF-β1、α-SMA、NOX4的表达，PCR检测NOX4的表达情况。结果：与假手术组比，模型组大鼠肾间质纤维化程度加重，且随着输尿管梗阻时间延长而加重（P＜0.05）；与模型组比较，苯那普利组大鼠肾间质纤维化程度减轻（P＜0.05）。免疫组织化学染色与PCR结果显示：与假手术组比，模型组肾组织TGF-β1、α-SMA、NOX4表达明显增多（P＜0.05）；与模型组比，苯那普利组大鼠TGF-β1、α-SMA、NOX4表达降低（P＜0.05）。结论：苯那普利能下调单侧输尿管梗阻大鼠肾小管TGF-β1、α-SMA、NOX4的表达，可能是其抗肾纤维化作用的机制之一。

单侧输尿管结扎；转化生长因子-β1；α平滑肌肌动蛋白；NADPH氧化酶；肾纤维化；苯那普利

Abstract: Objective:To observe the effects of Benazepril on expression of TGF-β1, α-SMA, NOX4 in renal tissues of rats with unilateral ureteral obstruction (UUO) and investigate the mechanism of it in renal interstitial fibrosis.Methods:The male Sprague-Dawley (SD) rats (54 cases) were randomly divided into Sham-operated group, model group and Benazepril treated group, 18 rats in each group. The benazepril group was given 1.6 mg/kg intragastric administration 1 times a day, and the model group and the sham operation group were given 10 mL/kg 0.9% sodium chloride solution gavage 1 times a day, model group and the benazepril group were ligated left ureter to establish UUO models. At days 7, 14 and 21, six rats in each group were sacrificed. Their left surgery renal tissues were collected for pathological examination. The pathological changes of the obstruction renal tissue were examined by Masson staining. The protein and gene expression of TGF-β1, α-SMA, NOX4 was detected by immunohistochemical staining respectively and NOX4 was detected by RT-PCR.Results:Compared with the Sham-operation group, the renal interstitial fibrosis degree of rats in other groups was increased(P＜0.05), and aggratated as the ureteral obstruction time prolonged. Compared with the model group, after the treatment, the renal interstitial fibrosis degree decreased significantly (P＜0.05). Compared with the Sham-operation group, the protein expression of TGF-β1, α-SMA, NOX4 in other group increased (P＜0.05). Compared with the model group, after the treatment by Benazepril, the protein expression TGF-β1, α-SMA, NOX4 was down-regulated in the renal tissue (P＜0.05). Conclusion: Benazepril may effectively retard kidney interstitial fibrosis by reducing the expression of TGF-β1, α-SMA, NOX4 to inhibit inflammatory of kidney.

Key words:unilateral ureteral obstruction; TGF-β1; α-SMA; NOX4; renal interstitial fibrosis; Benazepril

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是导致终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）的全因死亡高危因素。干预早、中期的CKD对预防其进展到ESRD尤其重要。肾脏纤维化是CKD进展的共同通路，所以，抑制肾脏纤维化是CKD早、中期治疗的关键环节。研究证实NOX4信号通路在调节炎症、抑制肾纤维化中发挥重要作用[1]。苯那普利通过抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS），降低肾小球囊内压、高灌注、高滤过，延缓慢性肾脏病的进展。本研究通过观察苯那普利对单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）肾纤维化大鼠模型NOX4、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1，）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的影响，探讨其抗肾纤维化的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性SD大鼠54只，体质量（200±20）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002，分笼饲养于温州医科大学实验动物中心，人工光照，明暗各12 h，饲养期间进食标准饲料，自由饮水。

1.1.2 药物与试剂：苯那普利（上海延慕实业有限公司）；兔抗大鼠TGF-β1抗体（美国Santa公司）；兔抗大鼠α-SMA抗体、兔抗大鼠NOX4单克隆抗体（美国Abcam公司）；GTVisionTM I I I抗鼠/兔通用型免疫组织化学检测试剂盒（上海基因科技有限公司）；HE染色试剂盒（南京建成生物工程研究所）；DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）。

1.1.3 仪器：组织脱水机（KD-TS3A，郑州南北仪器设备有限公司）；病理切片机（RM2235，德国Leica公司）；光学显微镜（BX51，日本Olympus公司）；电子天平（FA2004N，上海精密科学仪器有限公司）；微量加样枪（德国Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组、造模及给药：54只SPF级雄性SD大鼠适应性饲养5 d后，按随机数字表法分为假手术组（n=18）、模型组（n=18）和苯那普利组（n=18）。模型组和苯那普利组采用结扎单侧输尿管建立肾间质纤维化大鼠模型：禁食不禁水12 h，称体质量，以10%水合氯醛（3.5 μL/g）腹腔注射麻醉，取右侧卧位固定于手术台，剪除左侧腹部被毛，常规碘伏消毒，从背部距左侧肋脊角1.5 cm处做1.2～1.5 cm的斜向切口，逐层剪开皮肤、肌肉，开腹后暴露左侧肾脏，游离左输尿管，分别于约肾盂处和输尿管上1/3处双重结扎，后纳肾归原位，然后逐层缝合。假手术组开腹后分离左侧输尿管，但不结扎[1]。造模后第2天开始给药，每日称体质量，假手术组、模型组予10 mL/kg 0.9%氯化钠溶液灌胃，每天1次，苯那普利组予苯那普利灌胃，剂量为1.6 mg/kg，每天1次。

1.2.2 标本收集和处理：各组大鼠分别于给药第7、第14、第21天后随机取6只，禁食不禁水1 d后处死，取左肾，除去包膜，放出积水，迅速分切肾组织，将其中一份于中性甲醛溶液中固定，其余组织用0.9%氯化钠溶液冲洗后迅速置于液氮中冻存，转置-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3 指标检测

1.3.1 大鼠一般情况：观察各组大鼠造模后、给药过程中的精神状态、活动度、体毛色泽以及大便形状等情况。

1.3.2 Masson染色：取经中性甲醛溶液固定24 h的肾脏组织标本，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成3 μm厚石蜡切片，按常规方法行Masson染色后进行肾间质纤维化指数评分：在400倍视野下，每只大鼠选取5张组织切片，每张切片随机选取5个互不重叠的肾皮质区肾小管间质视野，计算视野中胶原染色阳性面积占整个视野面积的百分比，然后取平均值。标准如下：0分，纤维化阳性面积＜2%；1分，纤维化阳性面积2%～10%；2分，纤维化阳性面积11%～20%；3分，纤维化阳性面积21%～30%；4分，纤维化阳性面积＞30%[2]。

1.3.3 免疫组织化学染色：采用免疫组织化学法检测肾组织TGF-β1、α-SMA、NOX4表达。3 μm石蜡切片，常规脱蜡水化，枸橼酸盐缓冲液（pH值6.0）中高压煮沸修复抗原，加3% H2O2孵育20 min，滴加山羊血清封闭液封闭30 min，滴加一抗，TGF-β1（1∶100）、α-SMA（1∶500）、抗NOX4（1∶100），4 ℃过夜；滴加聚合辣根过氧化物酶标记的二抗，DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素复染，脱水、透明、封片。400倍光镜下观察，棕黄色部分为阳性染色，每张切片随机选取5个非重叠视野，使用Image Pro Plus软件分析每张图像中阳性染色面积百分比，取其平均值作为本张切片的结果。

1.3.4 RT-PCR法检测肾组织NOX4 mRNA表达：提取肾组织总RNA后，用紫外分光光度计测各组样品RNA纯度，以20 μL为体系进行反转录反应，以25 μL为反应体系进行PCR扩增，内含25×SYBR Green I荧光染料1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，双蒸水14.7 μL，cDNA 1.0 μL，每个样本设3个复孔。反应程序为95 ℃预变性90 s，退火5 s，58 ℃延伸30 s，共40个循环，每个循环结束后采集荧光信号。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料以 ±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 假手术组大鼠术后第1天饮食饮水、活动恢复正常，精力充沛，被毛光泽，大便正常；模型组大鼠术后饮食饮水、活动度恢复较慢，精神欠佳，大便偏硬；苯那普利组大鼠术后3 d开始恢复正常饮食饮水，精神尚可，活动较假手术组稍少，大便软。各组大鼠体毛肉眼观察未见明显区别，光泽度均可。

2.2 Masson染色 假手术组肾组织Masson染色未见明显病理改变，仅见肾小管基膜处呈线状分布的蓝染的胶原组织。模型组随着梗阻时间的延长，间质中蓝染的胶原纤维逐渐增多，提示纤维化进行性加重。胶原半定量分析显示，与假手术组比，模型组纤维化指数显著增加（P＜0.05），随着梗阻时间延长，肾小管间质纤维化逐渐加重（P＜0.05）。与模型组比，经苯那普利治疗后，肾纤维化指数减轻（P＜0.05）。见表1和图1。2.3 TGF-β1表达 假手术组TGF-β1有微量表达，模型组大鼠肾小管上皮细胞、炎性细胞、间质成纤维细胞中TGF-β1均有不同程度的表达，在病变肾小管上皮细胞内表达更为显著，随着时间延长，TGF-β1所占阳性面积百分比逐渐加重，差异均有统计学意义（P＜0.05），且均显著高于假手术组（P＜0.05）。与模型组比较，苯那普利组TGF-β1表达均有降低（P＜0.05）。见表2和图2。

表1 各组大鼠不同时间的肾间质纤维化指数（n=6， ±s）

图1 Masson染色评价肾间质纤维化情况（×400）

表2 各组大鼠肾间质中TGF-β1表达阳性面积百分比（n=6，±s，%）

图2 各组肾组织中TGF-β1的表达（×400）

2.4 α-SMA的表达 在假手术组中，仅见小动脉层中表达棕褐色的α-SMA，肾间质中未见表达。模型组可见肾间质中出现大量α-SMA表达，随着梗阻时间延长，各模型组肾间质α-SMA的表达量增加，且均显著高于假手术组（P＜0.05）。与模型组比，经苯那普利治疗后表达降低（P＜0.05）。见表3和图3。

表3 各组大鼠肾间质中α-SMA表达阳性面积百分比（n=6，±s，%）

2.5 NOX4的表达 假手术组肾组织中只有少量NOX4表达，在相应时间点模型组NOX4的表达明显高于假手术组（P＜0.01）；与模型组比，苯那普利组NOX4表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4和图4。

表4 各组肾组织中NOX4表达阳性面积百分比（n=6，±s，%）

2.6 NOX4 mRNA表达 各组大鼠肾脏均有NOX4 mRNA表达，假手术组有较弱表达，模型组、苯那普利组大鼠肾组织表达较假手术组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。苯那普利组表达较模型组明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

图3 各组肾组织中α-SMA的表达（×400）

3 讨论

研究发现中国成年人群CKD的患病率高达10.8%，并呈逐年上升趋势[1]。肾间质纤维化是多种肾脏病的基本病理基础，与肾小球硬化相比，肾间质纤维化与肾功能减退关系更为密切[2]。肾纤维化是慢性肾脏病发展至终末期的共同途径，TGF-β1在肾纤维化的发生发展中发挥重要作用。TGF-β1启动并调节上皮细胞向间充质细胞转化的全过程，是肾纤化过程的中心介导者和主要途径[3-4]。α-SMA是上皮细胞转分化的指标，是肌成纤维细胞产生的标志[5]，是肾纤维化发生发展过程中最重要的因子之一[6]。本研究结果显示，造模后TGF-β1、α-SMA表达明显上调，且随着梗阻时间的延长，表达逐渐增加，表明模型组大鼠发生了上皮细胞转分化，且随着时间延长，上皮细胞间充质转化的程度加重；经过苯那普利治疗后，TGF-β1、α-SMA表达量降低。已有研究表明苯那普利是通过下调TGF-β1、α-SMA蛋白水平的表达从而抗上皮细胞转化作用[7-8]。

肾间质纤维化的发生发展与肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）密切相关，阻断RAS对肾有保护作用。苯那普利对血管紧张素转换酶有较强的抑制作用，引起血浆血管紧张素I I（angio-tensin，Ang I I）浓度减低，并导致血浆肾素活性增加和醛固酮水平降低，抑制Ang I I在肾脏的血流动力学及非血流动力学的作用，特别是Ang I I也可以刺激NOX的多个亚基使之激活，产生ROS以及H2O2，并导致线粒体内ROS的积聚，而ROS又可以作为Ang I I的信号分子去执行Ang I I的细胞毒性作用[9]，从而抑制NOX的多个亚基激活，缓解肾纤维化进展。NOX有7种亚型，分别为NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2[10]，在肾组织中表达的主要是NOX4，主要在肾小管中表达，可能作为一种敏感性氧感受器。RAAS的激活促进NOX4产生过量的ROS，氧化应激的水平升高，促进肾纤维化，NOX产生的ROS介导Ang I I、TGF-β1、蛋白激酶C促肾纤维化，与肾间质纤维化的发生发展有着密切的联系[11]。本研究结果表明，苯那普利通过抑制RAS激活，抑制Ang I I水平，下调NOX4的基因表达；苯那普利组与模型组比，病理肾间质纤维化指数降低，表明苯那普利除了抑制Ang I I在肾脏的血流动力学作用，同时从非血流动力学方面，下调NOX4的表达，减轻氧化损伤，改善UUO肾脏病理，改善肾间质纤维化的进展。

图4 各组肾组织中NOX4的表达（×400）

表5 各组大鼠肾间质中NOX4 mRNA相对表达量（n=6，±s）

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（本文编辑：赵翠翠）

Effect of Benazepril on expression of TGF-β1, α-SMA and NOX4 in renal tissues of rats with unilateral ureteral obstruction

ZHAO Yanyun1, XIANG Xielong2, JIAN Yijuan2, DONG Feixia2,3. 1.Department ofPharmacology, Wenzhou Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University, Wenzhou, 325000; 2.Department of Nephrology, Wenzhou Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University, Wenzhou, 325000; 3.Department of Nephrology, Wenzhou Geriatric Hospital, Wenzhou, 325000

R966

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.005

2017-03-20

浙江省自然科学基金资助项目（LY14H270001）；浙江省中医药管理局课题（2013ZB121）；温州市科技计划项目（Y20170692）。

赵燕云（1973-），女，内蒙古乌兰察布人，副主任药师。

董飞侠，主任医师，Email：cgrsfhtd@163.com。