片仔癀对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞生物学行为的抑制作用

2017-10-12 06:48张忠提王丹王振华
中国医科大学学报 2017年10期
关键词:舌癌片仔癀抑制率

张忠提,王丹,王振华

(中国医科大学 1. 附属口腔医院干诊科,沈阳 110002; 2. 基础医学院生理学教研室,沈阳 110122)

片仔癀对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞生物学行为的抑制作用

张忠提1,王丹2,王振华2

(中国医科大学 1. 附属口腔医院干诊科,沈阳 110002; 2. 基础医学院生理学教研室,沈阳 110122)

目的探讨中药片仔癀对舌鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响及分子机制。方法将不同浓度的片仔癀作用于Tca8113细胞,应用MTT法检测Tca8113细胞的增殖情况,应用碘化丙啶(PI)染色检测细胞周期的变化,应用Western blotting检测细胞中信号转导子与转录激活子3磷酸化蛋白(p-STAT3)、Bcl-2蛋白表达的变化。结果MTT实验结果显示,片仔癀呈剂量依赖性抑制Tca8113细胞的增殖。PI染色结果显示,片仔癀使细胞周期在G0/G1期发生阻滞。Western blotting结果提示,片仔癀抑制STAT3蛋白的磷酸化,抑制Bcl-2蛋白表达。结论片仔癀对舌鳞状细胞癌细胞的增殖具有抑制作用。

片仔癀; 舌鳞状细胞癌细胞; 细胞增殖

Abstract ObjectiveTo investigate the effects of Pien Tze Huang on the biological behavior of tongue squamous carcinoma Tca8113 cells and its molecular mechanism.MethodsTca8113 cells were incubated with Pien Tze Huang at different doses. The proliferation of Tca8113 cells was examined by MTT assay. The distribution of the cell cycle was evaluated by PI staining. The expression of the p-STAT3 and Bcl-2 proteins was assessed by Western blotting.ResultsMTT assay showed that Pien Tze Huang inhibited the proliferation of Tca8113 cells in a dose-dependent manner. PI staining showed that Pien Tze Huang arrested cells in the G0/G1phase. The results of Western blotting suggested that Pien Tze Huang inhibited STAT3 protein phosphorylation and Bcl-2 protein expression.ConclusionPien Tze Huang inhibits the proliferation of tongue squamous carcinoma cells.

KeywordsPien Tze Huang; tongue squamous carcinoma cell; cell proliferation

舌鳞状细胞癌一般恶性程度较高、生长快、浸润性强,且由于舌体淋巴管和血液循环非常丰富等原因,癌细胞早期常发生转移且转移率较高。舌癌的治疗主要是以手术为主,Ⅲ~Ⅳ期晚期舌癌患者还需接受放化疗,并辅以中医药的综合治疗[1-3]。在患者术后或放、化疗期间配合使用某些中草药,可提高机体免疫功能,诱导癌细胞凋亡,抑制癌细胞生长,而且不良反应较小,对稳定病情有一定的效果。片仔癀是历史悠久的传统中成药,具有散瘀止痛、散结解毒等功效,它可在结肠癌等多种恶性肿瘤中发挥很好的抑癌作用,提高患者的生存质量、延长生存时间[4-5]。中医中药在治疗舌癌方面亦有重要地位,寻找一种效果好、不良反应小的中药制剂有利于舌癌患者的病情控制。本研究拟探讨不同浓度的片仔癀对舌癌Tca8113细胞的生长、增殖及细胞周期的剂量作用关系及可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

Tca8113细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所。片仔癀购自漳州片仔癀药业股份有限公司;RPMI-1640购自美国Gibco公司;MTT、鼠抗GAPDH购自美国Sigma公司;ECL购自英国Amersham Biosciences公司;兔抗人信号转导子与转录激活子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)磷 酸 化 蛋 白(phospho-STAT3,p-STAT3)、Bcl-2抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养Tca8113细胞,细胞呈贴壁生长,置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。取对数生长期的Tca8113细胞,分别加入不同浓度(0、200、400、800 μ g/mL)的片仔癀48 h后,于倒置显微镜下观察细胞生长状况并拍照。

1.2.2 MTT法:取对数生长期的Tca8113细胞,加入含有不同浓度(200、400、600、800、1 000 μ g/mL)的片仔癀,每个浓度设5个复孔,继续培养24 h、48 h后,加入5 mg/mL的MTT溶液,37 ℃孵育4 h,弃上清,每孔加入DMSO 150 μ L充分混合,震荡15 min,用酶标仪测定在570 nm处的光密度(optical density,OD)值。根据各组的OD值计算出药物对细胞增殖抑制率,公式如下:抑制率(%) =1- (加药组平均OD值/对照组平均OD值)×100。

1.2.3 碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色:应用流式细胞仪检测不同浓度(0、300、450、600 μ g/mL)的片仔癀对Tca8113细胞周期的影响,将各实验组细胞培养48 h后进行检测,PBS漂洗后2 000 r/min离心5 min,细胞加入预冷的70%乙醇-20 ℃固定,用500 μ L PBS重悬细胞,加入核糖核酸酶A和5 μ L PI,室温避光30 min后,用于检测Tca8113细胞周期的变化。

1.2.4 Western blotting:应用Western blotting方法检测不同浓度(0、300、450、600 μ g/mL)的片仔癀对Tca8113细胞中p-STAT3、Bcl-2蛋白表达的影响,各实验组细胞培养48 h后,PBS洗涤后加入细胞裂解液,收集总蛋白。以BCA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度。配制10%分离胶和4%浓缩胶。电泳后转印2 h,转至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉的封闭液孵育1 h,在兔抗p-STAT3、Bcl-2及鼠抗GAPDH一抗中4 ℃过夜,稀释相应的二抗室温孵育2 h,用TBST洗3次,每次10 min。ECL显色,图像用Chemi Imager 5500 V2.0软件扫描。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,多组间数据的比较采用单因素方差分析,2组间的比较采用t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 片仔癀对Tca8113细胞形态的影响

显微镜下所见,对照组细胞形态规则,多角形居多,体积较大,细胞饱满。加入不同浓度的片仔癀48 h后,细胞的形态和体积以及细胞密度均发生改变,随着药物浓度的增加,细胞变形、体积变小,甚至皱缩,部分可见细胞碎片,细胞密度愈加稀疏。表明片仔癀可促进Tca8113细胞发生凋亡、坏死。见图1。

图1 不同浓度的片仔癀对Tca8113细胞形态的影响 ×200Fig.1 Effect of Pien Tze Huang on cell morphology at different doses ×200

2.2 片仔癀抑制Tca8113细胞的增殖

片仔癀抑制Tca8113细胞的增殖,且随着给药浓度的增加,片仔癀对Tca8113细胞的增殖抑制率显著升高(P < 0.01),同一浓度下给药48 h与给药24 h相比,对Tca8113细胞的增殖抑制率显著增加(P <0.01)。见表1。

表1 片仔癀对Tca8113细胞的增殖抑制率(%)Tab.1 Proliferation inhibition rate of Tca8113 cells incubated with Pien Tze Huang (%)

2.3 片仔癀对Tca8113细胞周期的影响

应用流式细胞仪检测片仔癀对Tca8113细胞的细胞周期分布的改变。片仔癀使细胞周期在G0/G1期发生阻滞,细胞比例随给药浓度增加而增加,同时伴有S期细胞比例下降(P < 0.01)。见表2。

表2 片仔癀作用48 h后对Tca8113细胞周期各期细胞比例的影响(%)Tab.2 Changes of cell proportion in the cell cycle of Tca8113 cells incubated with Pien Tze Huang for 48 h(%)

2.4 片仔癀对p-STAT3、Bcl-2蛋白表达的影响

片仔癀作用Tca8113细胞48 h后,p-STAT3、Bcl-2蛋白表达水平明显降低,并随给药浓度增加而逐渐下降(图2)。Western blotting结果提示,片仔癀抑制STAT3蛋白的磷酸化,抑制抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表达。

3 讨论

图2 片仔癀对Tca8113细胞中p-STAT3、Bcl-2蛋白表达的影响Fig.2 Effect of Pien Tze Huang on the expression of the p-STAT3 and Bcl-2 proteins in Tca8113 cells

不同浓度的片仔癀作用于舌鳞状细胞癌Tca8113细胞24 h或48 h,对癌细胞的增殖有显著抑制作用,这一抑制效应随着给药浓度和给药时间的增加而增强。PI染色实验结果亦显示,不同浓度的片仔癀作用Tca8113细胞48 h可显著抑制细胞周期于G0/G1期,与MTT增殖实验结果一致。Western blotting结果显示,p-STAT3、Bcl-2信号分子可能参与了片仔癀抑制Tca8113细胞增殖这一生物学过程。

由于近年来人们生活节奏和生活方式的变化等原因,舌癌的发生率有逐年升高的趋势。舌是味觉、辅助发音、帮助吞咽、搅拌食物的重要器官,因此舌癌患者的生活质量会严重下降。而对于一些中晚期不能手术或术后、放化疗后发生复发转移的舌癌患者,通过中医药的辅助治疗可明显改善患者的症状,减轻患者的痛苦。片仔癀是国家一级中药保护品种,是源于明朝宫廷秘方研制的一种特效消肿退烧的中成药。主要成分包括清热解毒的牛黄、蛇胆,消肿止痛的麝香和散瘀消肿止痛的三七。片仔癀作用较广泛,可保护肝脏、清热降火、美容养颜、消除“温、热、毒、邪”,还可以作为抗肿瘤的辅助用药[6]。有文献[7]报道片仔癀可通过多途径诱导人骨肉瘤MG63细胞的凋亡。片仔癀还可抑制转化生长因子β信号通路,降低结肠癌细胞的肝转移[8],亦可通过抑制肿瘤血管新生达到抑癌作用[9]。片仔癀在舌癌方面的研究还未见报道。

本研究设立片仔癀的不同浓度给药组(200、400、600、800、1 000 μ g/mL)分别作用于Tca8113细胞24 h或48 h,观察不同浓度、不同作用时间片仔癀对Tca8113细胞增殖的影响。MTT实验结果显示,片仔癀可显著抑制Tca8113细胞的增殖,呈剂量依赖性和时间依赖性,镜下观察片仔癀浓度越高,处理的细胞形态呈凋亡样变化越明显。本研究还观察了3个不同浓度的片仔癀对细胞周期进程的作用,结果显示片仔癀作用使G0/G1期细胞比例较对照组显著增加,即片仔癀可使Tca8113细胞阻滞于G0/G1期。这些结果证实了片仔癀可有效地抑制舌鳞状细胞癌细胞的增殖。

STAT3是细胞内重要的信号传递因子,它在肿瘤生长、凋亡、迁移与侵袭、血管生长等方面都有重要作用,其下游靶基因较多,比如抗凋亡基因Bcl-2、Mcl-1,又有促进增殖方面的相关基因如CyclinD1、C-myc等[10-11]。本研究发现片仔癀可抑制STAT3的磷酸化激活,其中600 μ g/mL给药组抑制效果最强。片仔癀对STAT3下游靶基因Bcl-2表达水平的影响与p-STAT3的表达变化一致,说明STAT3/Bcl-2信号分子的下调参与了片仔癀抑制舌癌细胞增殖的这一生物学过程。本研究为片仔癀在抗肿瘤领域的临床应用提供了实验依据。

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(编辑 陈 姜)

Pien Tze Huang Inhibits the Biological Behavior of Tongue Squamous Carcinoma Tca8113 Cells

ZHANG Zhongti1,WANG Dan2,WANG Zhenhua2

(1. VIP Department,School of Stomatology,China Medical University,Shenyang 110002,China; 2. Department of Physiology,College of Basic Medical Sciences,China Medical University,Shenyang 110122,China)

R739.86

A

0258-4646(2017)10-0899-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170927.1452.018.html

10.12007/j.issn.0258‐4646.2017.10.009

辽宁省自然科学基金(2015020558,2015020750);辽宁省临床能力建设项目(LNCCC-D17-2015)

张忠提(1972 -),男,副教授,博士.

张忠提,E-mail:zhangzhongti@163.com

2017-04-12

网络出版时间:2017-09-27 14:52

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