超声作用下2种压电陶瓷多孔支架材料上成骨细胞的增殖与分化

全泉，矫义来，曹洪娟，吴琳

（1. 中国医科大学附属口腔医院修复一科，沈阳 110002；2. 中国科学院金属研究所材料特种制备与加工研究部，沈阳 110016）

超声作用下2种压电陶瓷多孔支架材料上成骨细胞的增殖与分化

全泉1，矫义来2，曹洪娟1，吴琳1

（1. 中国医科大学附属口腔医院修复一科，沈阳 110002；2. 中国科学院金属研究所材料特种制备与加工研究部，沈阳 110016）

目的在低强度脉冲超声波（LIPUS）作用下对比研究钛酸钡/微弧氧化钛合金多孔材料（简称BaTiO3）和氧化锌/微弧氧化钛合金多孔材料（简称ZnO）的表面MC3T3-E1成骨细胞增殖和分化的特性。方法分别将BaTiO3和ZnO这2种材料随机分成超声组（UBaTiO3组和UZnO组）和对照组（CBaTiO3组和CZnO组），将MC3T3-E1成骨细胞与材料复合培养，超声组每天接受20 min LIPUS辐照，对照组为不开功率源假辐照。通过检测噻唑兰（MTT）、碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OCN ）值观察成骨细胞增殖和分化的水平。结果4 d时UBaTiO3组MTT值高于CBaTiO3组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；1、4和7 d时UBaTiO3组和CBaTiO3组的MTT值均高于UZnO组和CZnO组，差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。4和7 d时UBaTiO3组的ALP值高于CBaTiO3组，7 d时UZnO组的ALP值高于CZnO组，差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）；4和7 d时UBaTiO3组和CBaTiO3组的ALP值均高于UZnO组和CZnO组，差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。7、10和14 d时UBaTiO3组的OCN值高于CBaTiO3组，14 d时UZnO组的OCN值高于CZnO组，差异均有统计学意义（P ＜ 0.05），7、10和14 d时UBaTiO3组的OCN值高于UZnO组，10和14 d时CBaTiO3组的OCN值高于CZnO组，差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。结论LIPUS可以促进 BaTiO3和ZnO这2种材料上MC3T3-E1的增殖与分化。在LIPUS作用下，BaTiO3材料优于ZnO材料，更具有成为骨修复材料的潜能。

低强度脉冲超声波； 成骨细胞； 压电陶瓷； 压电效应

Abstract ObjectiveTo evaluate the effects of low-intensity pulsed ultrasound （LIPUS） treatment on the proliferation and differentiation of osteoblasts cultured on barium titanate/titanium alloy （BaTiO3） and zinc oxide/titanium alloy （ZnO） piezoelectric ceramic composite scaffolds.MethodsThe BaTiO3and ZnO porous composite scaffolds were randomly divided into ultrasound （UBaTiO3and UZnO） and control （CBaTiO3and CZnO） groups，and MC3T3-E1 cells were cultured on the surface of the materials in each group. Cells in the ultrasound groups were subjected to a 20-min treatment LIPUS session daily，and the control group was sham-treated without the power source.The proliferation and differentiation rates of osteoblasts were evaluated using methyl thiazolyl tetrazolium （MTT），alkaline phosphatase（ALP），and osteocalcin （OCN） assays.ResultsSignificant differences in the MTT values were observed between the UBaTiO3and CBa-TiO3groups at day 4 （P ＜ 0.05） and between the UBaTiO3and UZnO groups at days 1，4，and 7 （P ＜ 0.05）. Compared with the CBaTiO3group，the UBaTiO3group showed significantly higher ALP activity and OCN levels at days 4 and 7 （P ＜ 0.05）. Further，a significant difference in the ALP and OCN values between the UBaTiO3and UZnO groups （P ＜ 0.05） was observed.ConclusionLIPUS promotes the proliferation and differentiation of osteoblasts on BaTiO3and ZnO scaffolds. BaTiO3scaffolds enable better promotion of osteogenesis under LIPUS treatment than ZnO scaffolds do.

Keywordslow-intensity pulsed ultrasound； osteoblast； piezoelectric ceramic； piezoelectric effect

近年来，临床上大段骨或大面积骨缺损的治疗难题导致对骨缺损修复材料的需求不断加大，因此学者们对人工骨材料的研发热情也不断增高。理想的人工骨材料要具备与骨相似的机械性能、良好的可加工性、骨传导性、骨诱导性及生物降解性。目前用于骨缺损修复的材料有钛及钛合金、生物陶瓷、高分子材料及其复合材料，压电材料由于具有与骨本身相同的压电效应而备受关注［1］。1880年居里兄弟发现，当外界机械力对压电材料挤压或拉伸时，其两端会产生不同的电荷，这种效应称为压电效应［2］。压电陶瓷具备陶瓷材料良好的生物相容性，并且将其植入后可以不需要外电源，依靠机体自身的活动将骨组织的力传导至材料而产生压电效应，产生适合的电刺激。本研究使用的2种材料是由中国科学院金属研究所提供的钛酸钡/微弧氧化钛合金多孔材料（简称BaTiO3）和氧化锌/微弧氧化钛合金多孔材料（简称ZnO）。多孔材料的结构特点：（1）钛合金支架是高强韧的多孔支架，可以提供骨组织生长的空间，多孔材料表面粗糙有利于细胞的粘附；（2）孔隙率和孔径的调控可以使其与骨组织弹性模量匹配；（3）多孔材料的骨传导性可促进骨组织的修复和提高植入物的长期稳定。

低强度脉冲超声波（low-intensity pulsed ultrasound stimulation，LIPUS）是一种强度较低、发射方式为脉冲式、能以压力波形式传送到人体内的非侵入性机械波。已有研究［3］表明，LIPUS可以通过调节细胞增殖，影响细胞因子分泌及促进基因表达，促进胶原和非胶原蛋白合成，诱导细胞分化而对细胞产生生物学效应。LIPUS产生的振荡压力、声流、微声流以及重复脉冲相互循环作用，为骨愈合提供力学环境，这些力的作用可以加快骨重建，改善骨痂结构，增强骨的力学性能［4］。压电陶瓷涂层通过机械力的激发产生微电流为成骨提供电环境，已有学者证实电环境有利于成骨效应［5］。本研究将MC3T3-E1成骨细胞分别与BaTiO3和 ZnO 2种材料复合培养，超声组给予LIPUS刺激，对照组为不开功率源的假辐照，比较材料表面MC3T3-E1成骨细胞的增殖与分化特性，为LIPUS的多因素作用下的高强韧多孔钛人工骨的开发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

BaTiO3多孔材料和ZnO多孔材料由中国科学院金属研究所制作提供，利用电子束逐层熔化技术打印钛合金支架，表面进行微弧氧化处理，再利用水热合成技术原位分别形成钛酸钡和氧化锌涂层，完成BaTiO3多孔材料和ZnO多孔材料的制作。样品规格为直径10 mm、厚5 mm的圆柱状，孔径400～500 μ m，孔隙率为65%～70%（图1）。依次放入丙酮、无水乙醇、蒸馏水浸泡10 min，放入电热恒温鼓风干燥箱干燥烘干后（150 ℃，30 min），高温高压灭菌后备用（121 ℃/0.21 MPa）。细胞接种前4 h，将高压灭菌后的支架材料放入培养液中，抽真空4 h以排出材料内气体，并使材料达到预湿润状态。

图1 扫描电镜观察材料表面形貌Fig.1 Morphology of the BaTiO3and ZnO porous scaffolds observed using scanning electron microscope

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 主要仪器：740型超声波发生器（美国Mettler Electronics公司），Hitachi S3400扫描电子显微镜（日本日立公司），Infinite M200酶标仪（奥地利Tecan公司）。

1.2.2 主要试剂：α-MEM培养基（美国HyClone公司），胎牛血清（美国ExCell公司），1%双抗（美国Gibco公司），超声耦合剂（西苑公司），MTT试剂、DMSO （美国Sigma公司），ALP试剂盒（南京建成有限公司），OCN检测试剂盒（北京鼎国试剂公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组：将BaTiO3多孔材料和ZnO多孔材料随机分为超声组（UBaTiO3组和UZnO组）和对照组（CBaTiO3组和CZnO组），保证每组样品数量不低于5。

1.3.2 超声加载：频率1 MHz，强度30 mW/cm2，脉冲宽度1 ms，脉冲重复频率100 Hz，20 min/次，1次/d。对照组为不开功率源的假辐照。

1.3.3 细胞培养：将经过真空排气和预湿的多孔支架材料放入 24 孔板中，待培养的小鼠MC3T3-E1成骨细胞（中国医科大学附属口腔医院中心实验室提供，第 20 代）融合度达到近 80%时，0.25%胰蛋白酶消化，吹打成细胞悬液，并将50 μ L细胞悬液缓慢均匀接种到支架材料上，37 ℃、5% CO2恒温培养箱中孵育 2 h 后，每孔缓慢加入1 mL改良的MEM培养基（α-MEM），内含10%胎牛血清、1%青霉素抗体、1%链霉素抗体，再次放入恒温培养箱中，待 24 h 细胞贴壁稳定后，将细胞脱落多于20个的样本丢弃，余留样本随机分为超声组和对照组，培养基每2 d更换1次。

1.3.4 MTT 检测：将 MC3T3-E1 与 UBaTiO3、UZnO、CBaTiO3和CZnO 4组支架材料复合培养于24孔板24 h后，超声组加载超声，对照组假辐照。1、4和7 d后吸弃培养基，PBS冲洗3次去除未粘附细胞，每孔加入800 μ L纯培养基和200 μ L MTT溶液，于37 ℃培养箱静置4 h，而后吸出每孔液体加入1 000 μ L DMSO振荡10 min使其充分溶解，将每孔液体吸出200 μ L放入96孔板，空白孔放入200 μ L DMSO，用酶标仪490 nm波长下测定各组光密度（optical density，OD）值。

1.3.5 ALP 检测：将 MC3T3-E1 与 UBaTiO3、UZnO、CBaTiO3和CZnO 4组支架材料复合培养于24孔板24 h后，超声组加载超声，对照组假辐照。培养1、4和7 d后，吸出培养基，PBS冲洗3遍，胰酶消化细胞，离心，再次加入PBS吹打材料上残余细胞，收集并离心，去上清液，加入曲拉通裂解液（0.3%）裂解细胞，同时进行-80 ℃与0 ℃反复冻融2次的物理裂解方法，最后4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清液，加入到96孔板，分别在酶标仪562 nm和520 nm波长下测得BCA标准蛋白量和ALP含量，计算ALP活力值，ALP活力（金氏单位/100 mL） = （测定OD-空白OD）/（标准OD-空白OD）×0.02/标准蛋白×106。

1.3.6 OCN检测：将MC3T3-E1成骨细胞与UBaTiO3、UZnO、CBaTiO3和CZnO 4组支架材料复合培养于24孔板24 h后，超声组加载超声，对照组假辐照。7、10和14 d后，吸取孔内培养基100 μ L，4 ℃、12 000 r/min离心5 min后取上清，依次在96孔板加入样品、标准品及空白对照组，生物素标记二抗及酶标试剂，37℃反应 60 min，洗板5次，加入显色剂A、B，37 ℃显色10 min，加入终止液，10 min内读取OD值，并按标准品绘制的标准曲线计算样本相应OCN含量。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，所有数据均用x-±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT值

各组MTT值均随培养时间增长而升高。第1、4和7 天时UBaTiO3组MTT值高于CBaTiO3组，且在第4天时差异有统计学意义（P = 0.006）。第1天时CZnO组MTT值高于UZnO组，第4和7天时UZnO组MTT值高于CZnO组，但差异均无统计学意义（P ＞ 0.05）。第1、4和7天时UBaTiO3组MTT值高于UZnO组，CBaTiO3组MTT值高于CZnO组，差异均有统计学意义（均P ＜ 0.05）。见表1。

2.2 ALP值

各组ALP活力值均随培养时间增长而升高。第1、4和7天时UBaTiO3组ALP值高于CBaTiO3组，且在第4和7 天时有统计学差异（均P ＜ 0.05）。第1、4和7天时UZnO组ALP值高于CZnO组，且在第7天时有统计学差异（P = 0.01）。第1、4和7天时UBaTiO3组ALP值高于UZnO组，且在第4和7天时有统计学差异（均P ＜0.05），第1、4和7天时CBaTiO3组ALP值高于CZnO组，且在第4和7天时有统计学差异（均P ＜ 0.05）。见表1。

表1 不同时间点各组MTT、ALP、OCN结果Tab.1 Results of the MTT，ALP，and OCN assays for the four groups at different time points

2.3 OCN值

各组OCN值均随培养时间增长而升高。第7、10和14天时UBaTiO3组OCN值高于CBaTiO3组，均有统计学差异（均P ＜ 0.05）。第7天时UZnO组与CZnO组比较OCN值无统计学差异，第10和14天时UZnO组OCN值高于CZnO组，且第14天时有统计学差异（P = 0.000 5）。第7、10和14天时UBaTiO3组OCN值高于UZnO组，差异均有统计学差异（均P ＜ 0.05），第7、10和14天时CBaTiO3组OCN值高于CZnO组，且在第10、14天时有统计学差异均（P ＜ 0.05）。见表1。

3 讨论

超声波是高频声压波（＞20 kHz），以机械振动的形式在生物组织内传递。LIPUS因其非侵入性、有效性、安全性、操作方便、治疗时间短，是近年来公认的能促进骨愈合修复的一种新的物理治疗方法。1994年和2000年相继得到美国食品药品监督管理局的批准，在临床上用于骨折和骨不连的治疗［6］。近年来，LIPUS作为非侵入性辅助手段与骨支架材料联合应用的研究，为大面积骨缺损的人工骨移植修复治疗提供了一个新的可行方案。

目前关于压电材料在骨移植材料领域的研究，钛酸钡基无铅压电陶瓷具有较高的优越性，实验研究显示它具有良好的生物相容性、良好的骨诱导性与骨传导性，可以作为直接的骨替代材料［7］。MARIANNA等［8］认为BaTiO3的压电效应能够促进细胞更快增殖，提高复合陶瓷的生物活性。ANTONELLA等［9］发现BaTiO3不仅具有良好的生物相容性，而且还保持了较高的介电常数与压电性能。但由于Ba-TiO3需要高温烧结（1 300～1 350 ℃），且烧结存在一定难度，越来越多学者开始关注其他类压电材料。ZnO压电陶瓷由于其成本低、光敏性好、氧化性强、无毒性以及优良的化学稳定性，引起科研工作者广泛的研究兴趣。在医学应用方面，人们最为广泛关注的是ZnO优越的抗菌性。刘冠花等［10］在研究防治种植体周围炎症中发现，通过在钛合金表面制备氧化锌涂层可达到良好抗菌效果。

在骨缺损研究中，为了更好地模拟细胞三维培养环境，三维支架材料的研究受到广泛关注。传统二维细胞培养系统与体内情况相异，细胞会逐渐失去原有的性状，但怎样实现三维支架内外的物质交换而为细胞生长提供良好的环境成为困扰学者们的一大难题，学者们开始将LIPUS作为辅助手段并取得一定成果。WU等［11］的体外实验证实LIPUS可以提高成骨细胞在三维支架材料内的长入深度和细胞的DNA复制；HUANG等［12］认为LIPUS能够促进支架深部空隙区成骨细胞的增殖；胡莹等［13］认为LIPUS可与泡沫TiC/Ti联合应用促进骨缺修复。本研究以BaTiO3和ZnO三维支架材料作为细胞载体，发现 LIPUS促进了BaTiO3和ZnO三维支架与成骨细胞共培养体系中细胞的增殖与分化，这为LIPUS作为辅助手段配合压电陶瓷三维支架人工骨材料的应用提供了有益数据。

LIPUS可以使骨组织本身产生压电效应，但作用于压电材料后是否可以使材料产生压电效应尚无文献报道。本研究结果提示，在LIPUS作用下Ba-TiO3和ZnO复合材料均具有良好的生物相容性，且成骨细胞在BaTiO3表面的增殖与分化优于在ZnO表面，这其中包含了在LIPUS作用下结构、生化、力学、电学的综合效应。 LIPUS与BaTiO3、ZnO三维支架材料构建的结构、力学、生化和电学多因素环境促进了细胞的增殖与分化，但本研究并不能阐明具体是哪些因素导致了最终结果，这些因素的匹配关系和耦合作用及其促进骨生长的修复机制还有待进一步研究。

综上所述，LIPUS有利于MC3T3-E1成骨细胞在BaTiO3和ZnO复合材料上的增殖与分化，在LIPUS作用下BaTiO3复合材料优于ZnO复合材料，更具有成为人工骨代替品的潜能。

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（编辑 陈 姜）

Effect of Low-intensity Pulsed Ultrasound on the Proliferation and Differentiation of Osteoblasts Cultured on Two Piezoelectric Ceramic Porous Scaffolds

QUAN Quan1，JIAO Yilai2，CAO Hongjuan1，WU Lin1

（1. Department of Prosthodontics，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China； 2. Materials Fabrication and Processing Division，Institute of Metal Research，Chinese Academy of Sciences，Shenyang 110016，China）

R783.1

A

0258-4646（2017）10-0869-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170927.0942.004.html

10.12007/j.issn.0258‐4646.2017.10.002

国家高技术研究发展计划（863计划）（2015AA033702）；辽宁省自然科学基金（2014021008）

全泉（1984 -），女，主治医师，硕士.

吴琳，E-mail：wulin13@163.com

2016-12-15

网络出版时间：2017-09-27 09:42