miR-429 通过靶向作用Sox2抑制骨肉瘤干细胞特性

余铃，张政佩，孙祥然，郑迪，郭卫春

（武汉大学人民医院骨一科，武汉 430060）

miR-429 通过靶向作用Sox2抑制骨肉瘤干细胞特性

余铃，张政佩，孙祥然，郑迪，郭卫春

（武汉大学人民医院骨一科，武汉 430060）

目的探讨miR-429在骨肉瘤干细胞中的作用。方法利用不同方法筛选出骨肉瘤干细胞，检测miR-429的含量。利用分子探针技术将骨肉瘤细胞分为miR-429高表达组和低表达组，检测各组骨肉瘤细胞干细胞样特性。利用转染技术检测miR-429对骨肉瘤干细胞样特性的影响。利用荧光素酶报告基因系统，验证miR-429下游靶基因。结果骨肉瘤干细胞中miR-429的表达量明显减少。miR-429高表达细胞的干细胞特性明显低于miR-429低表达细胞，且转染实验验证了上述结果。荧光素酶报告实验显示，miR-429在转录后水平上负性调节Sox2基因。结论miR-429可以通过下调Sox2负性调节骨肉瘤干细胞特性。

骨肉瘤； 干细胞； miRNA-429； Sox2

Abstract ObjectiveTo investigate the role of miR-429 in osteosarcoma stem cells.MethodsWe employed different approaches to test the expression of miR-429 in osteosarcoma stem cells. miR-429-high and miR-429-low cells were separated using molecular probes and their stem cell-like properties were compared. The effect of miR-429 on osteosarcoma stem cell-like properties was further tested through transfection assays. Furthermore，the miR-429 downstream target gene was confirmed by luciferase assay.ResultsThe expression of miR-429 in osteosarcoma stem cells was much lower than that in control cells. miR-429-high cells displayed fewer stem celllike properties than did miR-429-low cells. These observations were confirmed by transfection assays. Additionally，our luciferase assays showed that miR-429 regulates Sox2 at the post-transcriptional level.ConclusionmiR-429 negatively regulates osteosarcoma stem celllike properties by targeting Sox2.

Keywordsosteosarcoma； stem cell；miR-429； Sox2

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于青少年［1］。传统化疗药物具有全身毒性，且选择性差，约有10%～25%的患者会发生转移和耐药，治疗效果差［2］。因此，有效的骨肉瘤靶向治疗是临床上亟待解决的问题。

肿瘤干细胞是指能够自我更新和多向分化潜能的肿瘤细胞，在肿瘤的发生、转移和耐药中扮演重要角色［3］。GIBBS等［4］最先发现了骨肉瘤细胞里的干细胞，其能够形成具有自我更新能力的肿瘤球。ADHIKARI等［5］利用表面标记CD-117/Stro-1分选出骨肉瘤干细胞，且这群细胞具有显著增高的化疗耐药和远处转移特性。miRNAs是一类短链非编码RNA，并在转录水平上调节基因的表达。miRNAs通常作用于目的mRNA的3’非编码区，进而引起基因表达的抑制甚至沉默［6］。但是miRNA与骨肉瘤干细胞的关系仍然不清楚。本研究拟探讨miR-429对骨肉瘤干细胞样特性的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

MG63细胞及HEK293细胞购自中国科学院细胞库。所有细胞均用含有10%胎牛血清和1%双抗的完全培养基进行培养。细胞放置在37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱里培养。利用台盼蓝染色确认细胞活力。

1.2 肿瘤悬浮成球实验

将骨肉瘤细胞接种于低黏附的6孔板上，将细胞密度调至每孔5 000个肿瘤细胞。培养基额外添加B27、10 ng/mL的EGF和bFGF（美 国Sigma-Aldrich公司）。细胞放至37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱里培养。EGF和bFGF每3 d更换1次。2周后直径＞50 μ m的球体被认定为克隆球，在倒置显微镜下计数。

1.3 流式细胞术

将肿瘤细胞放在含有0.5%正常兔血清（美国Sigma-Aldrich公司）的PBS中重悬并封闭15 min。细胞随后标记Stro-1和CD117的抗体（美国BioLegend公司），并在冰上维持60 min。利用流式细胞仪分析及记录结果，记录双阳性细胞比率。将miR-429 Hu-Cy5 SmartFlareTMRNA探针（美国Millipore公司）加入骨肉瘤细胞中，过夜处理16 h。利用流式细胞仪将细胞分选为miR-429高表达组和miR-429低表达组，分选出的细胞用于后续实验。

1.4 荧光素酶检测

基于pMIR-REPORT载体构建荧光素酶报道子（美国Ambion公司）。将含有miR-429连接端的Sox2-3’-UTR寡核苷酸链合成及退火后，导入荧光素酶报告基因载体。无功能的siRNA序列作为阴性对照。利用脂质体（美国Invitrogen公司）将Sox2-3’-UTR及对照质粒转染至HEK293细胞。

1.5 CCK8实验

收集细胞制成细胞悬液，用PBS调整细胞密度为1×105/mL。将各组细胞接种于96孔板中，每孔200 μ L，培养24 h。每孔加入10 μ L CCK-8试剂，37 ℃孵育2 h。采用酶标仪检测450 nm处的光密度值，计算细胞增殖率。每组实验均重复3次。

1.6 实时PCR

根据TRIZOL说明书提取总RNA。按照TaKaRa RNA PCR试剂盒上说明进行逆转录。应用7500 Fast Real-Time PCR System测定Ct值，以U6为内参照，以2-ΔΔCt表示mRNA的相对表达量。

1.7 Western blotting

细胞总蛋白提取按照试剂盒操作说明进行（美国Sigma-Aldrich公司）。取40 μ g细胞总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，封闭后加一抗anti-oct4（1∶1 000；TA324014，美国OriGene公司）或 anti-Sox2（1∶700；TA321559，美国OriGene公司），4 ℃ 过夜，弃去一抗后加二抗，室温孵育60 min，DAB显色，采用凝胶成像系统拍照并分析条带吸光度。

1.8 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，计量资料以x-±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-429在骨肉瘤干细胞中低表达

miR-429在MG63 CD117/Stro-1双阳性细胞群和MG63成球细胞中的表达量显著降低，顺铂筛选出的骨肉瘤干细胞中miR-429表达量也均低于对照组细胞。由此可见，miR-429可能参与调节骨肉瘤干细胞的生长。

2.2 miR-429过表达细胞中表现出较低的干细胞特性

图1 miR-429在骨肉瘤干细胞中的表达Fig.1 Expression of miR-429 in osteosarcoma stem cells

将骨肉瘤细胞MG63分为miR-429高表达组和低表达组，发现MG63细胞中的miR-429低表达组CD117和Stro-1双阳性比率均少于miR-429高表达组。miR-429高表达组中Oct4基因和Sox2基因的表达水平低于miR-429低表达组。悬浮成球实验结果显示，miR-429低表达组的细胞成球能力强于miR-429高表达组。见图2。

图2 miR-429过表达细胞中的干细胞特性Fig.2 Stem cell-like properties of miR-429-high and miR-429-low cells

2.3 miR-429抑制骨肉瘤干细胞特性

分别转染 pre-miR-429（miR-429过表达）、anti-miR-429（拮抗miR-429表达）以及阴性对照，结果发现CD117和Stro-1双阳性比率、悬浮成球能力在拮抗miR-429表达组增强，而在miR-429过表达组减少。提示miR-429为一种骨肉瘤干细胞的抑制剂。见图3。

图3 miR-429抑制骨肉瘤干细胞特性Fig.3 Downregulation of miR-429 expression promotes osteosarcoma stem cell-like properties

2.4 miR-429负性调控Sox2的表达

利用Target Scan工具搜索miR-429的目的基因，发现Sox2-3’-UTR可能是miR-429的靶向序列。将Sox2-3’-UTR-miR-429报道载体及其对照转染至HEK293细胞，结果显示荧光素酶活性与加入剂量明显相关，转染效力随着时间增加逐渐消失，2周后转染组与对照组无统计学差异。实时PCR结果发现miR-429过表达组Sox2的mRNA水平并无变化，而其蛋白水平在第7天miR-429过表达组明显减少，而miR-429拮抗组结果相反。这些结果表明miR-429在转录后水平调节Sox2的蛋白表达。见图4。

图4 miR-429负性调控Sox2的表达Fig.4 miR-429 downregulates Sox2 expression

3 讨论

越来越多的证据表明miRNAs在细胞的增殖、分化以及凋亡中扮演者重要的调控角色［11］。有研究［12］报道，miRNAs参与调控正常干细胞以及骨肉瘤干细胞的生长。本研究结果表明，miR-429在骨肉瘤干细胞中的表达量明显低于对照组，并负性调控骨肉瘤干细胞特性。

miR-429与肿瘤关系密切。miR-429在胃癌组织中表达显著下调，可能在胃癌的发生发展过程中起重要作用［13］。肺腺癌细胞中SPC-A1通过增加miR-429表达量抑制肺癌细胞增殖，促进细胞周期阻滞［14］。然而，miR-429与骨肉瘤干细胞的关系并不清楚。本研究选用3种不同的方法筛选骨肉瘤干细胞，证实了miR-429的表达量在骨肉瘤干细胞中明显减少。功能实验表明，下调miR-429能够促进骨肉瘤干细胞特性的表达，而上调miR-429所致的结果相反。

Sox2在维持骨肉瘤干细胞的生长上扮演者至关重要的角色［15］。通过Target Scan软件预测Sox2 3’-UTR与miR-429不完全互补，提示miR-429可能仅在蛋白水平上抑制Sox2的表达。荧光素酶报道实验及上下调功能实验证实了miR-429通过不完全的靶向作用抑制Sox2的表达。

然而，本研究仍存在一定的局限性。首先，未能提供人来源的骨肉瘤干细胞进行实验，进而验证miR-429对人骨肉瘤细胞的作用。第二，不确定miR-429在其他骨的恶性肿瘤中扮演的角色。第三，未能说明除了Sox2之外是否还有基因参与miR-429对骨肉瘤干细胞的调控。

综上所述，miR-429通过靶向Sox2调控骨肉瘤干细胞特性，可以为进一步研究miR-429骨肉瘤发生发展过程中所起的作用提供参考，并为研究骨肉瘤干细胞的功能提供理论支持。

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（编辑 于 溪）

miR-429 Negatively Regulates Osteosarcoma Stem Cell-like Properties by Targeting Sox2

YU Ling，ZHANG Zhengpei，SUN Xiangran，ZHENG Di，GUO Weichun

（Department of Orthopedics，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China）

R738.1

A

0258-4646（2017）10-0874-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170927.0942.006.html

10.12007/j.issn.0258‐4646.2017.10.003

国家自然科学基金（8150257）；中央高校基本科研基金（2042015kf0069）

余铃（1987-），男，主治医师，博士.

郭卫春，E-mail：guoweichun@aliyun.com

2017-03-13

网络出版时间：2017-09-27 09:42