COPD大鼠原代肺动脉平滑肌细胞中MCP-1、TGF-β1和TLR4蛋白的检测*

蒋 明 ，王昌明，韩旭惠，杨 丹，马礼兵，陈 峰，吕 倩

桂林医学院附属医院呼吸内科 广西桂林 541001

COPD大鼠原代肺动脉平滑肌细胞中MCP-1、TGF-β1和TLR4蛋白的检测*

蒋 明 ，王昌明#，韩旭惠，杨 丹，马礼兵，陈 峰，吕 倩

桂林医学院附属医院呼吸内科 广西桂林 541001

慢性阻塞性肺疾病；Toll样受体4；单核细胞趋化蛋白-1；转化生长因子-β1；大鼠

目的：探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠远端原代肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、转化生长因子-β1(TGF-β1)的分泌情况及其与Toll样受体4 (TLR4)信号通路的相关性。方法通过脂多糖(LPS)诱导建立大鼠COPD模型，分离培养、鉴定原代大鼠PASMCs，以LPS诱导PASMCs，然后分组(对照组、LPS组、TAK-242组，LPS+TAK-242组)培养细胞，用Western blot法检测各组PASMCs中TLR4的表达，ELISA法检测细胞培养上清液MCP-1、TGF-β1的浓度，并进行相关性分析。结果LPS组较对照组PASMCs中TLR4的表达水平上调(P<0.05)，细胞培养上清液中MCP-1、TGF-β1的含量升高(P<0.05)；TAK-242组PASMCs中TLR4的表达水平下调(P<0.05)，上清液中MCP-1、TGF-β1与TLR4无相关性。结论LPS可诱导大鼠原代PASMCs合成分泌MCP-1、TGF-β1，同时上调TLR4表达水平。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)主要的病理特征为血管炎症反应和血管重塑。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)是肺血管重塑的主要效应细胞。研究[1-3]表明，当受到有害因素刺激时，PASMCs表型发生转化，合成、分泌炎症因子及基质蛋白的活性增加，募集炎症细胞聚集和炎症级联放大，并促进PASMCs的增殖和迁移，促进肺血管重塑。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1， MCP-1)是一种趋化性细胞因子，可趋化激活巨噬细胞，参与介导继发性炎症反应[4]。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)属于TGF-β家族，是近年来新发现的调节细胞生长、分化的活性多肽类物质，对细胞的生长和分化等多种病理、生理过程有重要调节作用[5]。有研究[6]报道，与正常人比较，急性加重期和缓解期COPD患者血清MCP-1、TGF-β1的水平明显升高。Toll样受体4 (Toll-like receptor 4，TLR4)是第一个被发现的哺乳动物TLR，可被肽聚糖及脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)等激活来调节炎症反应[7]。作者通过建立COPD大鼠模型，分离培养大鼠原代PASMCs，探究COPD大鼠PASMCs合成、分泌MCP-1、TGF-β1的水平同TLR4信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器SPF级Wistar大鼠24只，雌雄各半，体重(200±20)g，6～8周龄，购自桂林医学院动物实验中心，大鼠在室温、安静和避强光环境中自由饮水和进食。实验动物合格证号：SCXKG 2014-0001。LPS(美国 Sigma 公司)，翻盖红色金牌黄果树香烟(贵阳卷烟厂出品，焦油量15 mg，烟气烟碱量1.2 mg)，DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)，TLR4鼠单克隆抗体(美国Abcam公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、β-actin小鼠单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，总蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，ELISA 试剂盒(美国 BENDER 公司)，自制91 cm×42 cm×62 cm有机玻璃舱，倒置相差显微镜(日本 Olympus)，美国Bio-Rad公司蛋白电泳及转膜仪、450型全自动酶标仪。

1.2动物模型的建立Wistar大鼠适应环境1周后，模型组于实验第1、14天经气道内注入LPS，每次200 μg/只，予自制有机玻璃舱内烟熏1 h/d，共8周，舱内有小孔可与外界空气相通，保持舱内气压与外界相等，舱内放置适量无水氯化钙吸收水分、保持干燥。对照组于实验第1、14天经气道注入等量生理盐水，其他不做任何处理，与模型组大鼠在同等条件下饲养8周。

1.3大鼠远端原代PASMCs分离、培养及鉴定采用酶消化法结合组织块贴壁法。Wistar 大鼠腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉，体积分数75%乙醇浸泡大鼠5 min，开胸取心肺，取肺动脉3级以下分支，分离血管中膜，Ⅰ型胶原酶37 ℃水浴消化15～20 min，离心、吸出消化酶，加入含体积分数25%胎牛血清的DMEM高糖培养液，置 37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养，4 d左右可见细胞从组织块周围萌出，10 d左右细胞生长融合达培养瓶的90%以上时即消化传代，选用第3～6代(达对数生长期)细胞用于该实验。PASMCs细胞爬片行免疫细胞化学染色鉴定。

1.4PASMCs中TLR4蛋白含量的Westernblot检测用LPS、TAK-242干预细胞后按如下方法进行分组(每组均设6个复孔)：对照组不做任何处理；LPS组加入LPS(终质量浓度为1 mg/L)，TAK-242组(终浓度为1 μmol/L)、LPS+TAK-242组(LPS终质量浓度为1 mg/L，TAK-242终浓度为1 μmol/L)培养24 h。提取PASMCs总蛋白，测定总蛋白浓度，计算上样量后上样，使每孔蛋白总量一致，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳约120 min；转膜，将PVDF膜用封闭液封闭2 h，加入TLR4单抗(按11 000稀释)4 ℃过夜，TBST漂洗膜3次， 10 min/次；二抗山羊抗鼠IgG(按15 000稀释)室温孵育2 h，最后发光，所得图像用Imag J软件进行灰度值分析。

1.5各组细胞培养上清液中MCP-1、TGF-β1水平的ELISA法检测细胞培养、分组和样本量同1.4。采用450型 ELISA 酶标仪，于波长595 nm处测定光密度值，利用 Revelation Spectra MR软件绘制标准曲线，通过标本的光密度值在标准曲线上得到标本的MCP-1、TGF-β1浓度。具体操作步骤按照试剂盒说明。

1.6统计学处理采用SPSS 18.0统计软件分析数据，应用2×2析因设计的方差分析比较各组PASMCs中TLR4蛋白含量和细胞培养上清液中MCP-1、TGF-β1水平的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1大鼠COPD建模的HE染色判断及PASMCs免疫细胞化学染色法鉴定见图1(箭头所标处为肺动脉)。对照组肺组织(图1A)肺泡结构完整，无炎细胞浸润；模型组肺组织(图1B)肺泡壁断裂、肺泡融合肺大泡形成，肺动脉平滑肌层明显增厚，大量炎细胞浸润，符合COPD大鼠肺组织病理改变。Α-SM-actin 免疫组织化学染色，光镜下见胞质内大部分肌动蛋白染成棕黄色，呈现与细胞长轴平行的丝状物，证实为 PASMCs(图1C)。

A：对照组；B：模型组；C：肌动蛋白免疫细胞化学染色。 图1 大鼠COPD建模的HE染色判断及PASMCs免疫细胞化学染色法鉴定(×200)

2.2各组PASMCs中TLR4蛋白含量的比较见图2及表1。LPS组细胞TLR4表达较对照组明显升高(P<0.05)；TAK-242组细胞TLR4的表达较对照组降低(P<0.05)；TAK-242组细胞较LPS组中TLR4的表达明显降低(P<0.01)。

A：对照组；B：LPS组；C：TAK-242组；D：LPS+TAK-242组。 图2 各组PASMCs中TLR4的表达

组别TLR4对照组0.917±0.019LPS组2.912±0.079TAK-242组0.623±0.006LPS+TAK-242组1.899±0.003

FLPS=43 461.403，FTAK-242=19 213.336，F交互=16 174.815;P均<0.001。

2.3各组细胞培养上清液中MCP-1、TGF-β1水平的比较见表2。

表2 各组细胞培养上清液中MCP-1、TGF-β1水平变化比较(n=6)

2.4MCP-1、TGF-β1表达水平与TLR4含量相关性分析COPD大鼠PASMCs上清液中MCP-1、TGF-β1表达水平与TLR4含量无关(rP=0.471和0.352，P>0.05)。

3 讨论

COPD是一种以气流受限为特征的肺部疾病，主要表现为加速下降的肺功能，严重影响患者生活质量，并带来沉重经济负担的疾病[8-9]。血管炎症反应和肺血管重塑是其主要病理特征。

TLRs是一类天然的免疫受体，促进细胞因子的合成与释放,引发炎症反应。TLR4是第一个被发现的哺乳动物TLR，属于Ⅰ型跨膜蛋白受体，可被病原微生物、肽聚糖(PGN)、LPS等激活，产生趋化因子、黏附分子、急性期蛋白及细胞因子来调节炎症反应。气道注入LPS和被动吸烟可能通过NF-κB信号通路引起肺损伤继而引发COPD，而TLR4在这一过程中起到重要作用[10]。该实验采用气道内注入LPS及香烟烟雾暴露方法建立COPD大鼠模型。COPD患者气道炎性细胞的浸润主要为淋巴细胞和巨噬细胞[11]。MCP-1是一种重要的趋化因子，与巨噬细胞的激活和趋化明显相关[12]。TGF-β1能够刺激成纤维细胞合成细胞外基质并抑制其降解，致使气道管壁增厚进而引发气道重塑，导致肺功能的进行性损害[13]。MCP-1和TGF-β1在COPD的发生、发展中起重要作用，与正常人比较，COPD患者急性加重期和缓解期MCP-1、TGF-β1的水平明显升高[6]。有研究[14]证实，在血管平滑肌细胞中TLR4/NF-κB信号通路可介导MCP-1的表达。该实验通过分离培养原代PASMCs，LPS诱导体外培养的细胞，发现TLR4的表达明显升高，细胞上清液中合成分泌MCP-1、TGF-β1的水平也明显升高用。为进一步探究PASMCs合成分泌MCP-1、TGF-β1的水平与TLR4之间的关系，以TLR4特异性抑制剂TAK-242干预细胞，发现可明显下调TLR4的表达，但细胞培养上清液中MCP-1、TGF-β1的水平并不随之降低。有研究[15]报道，COPD患者急性加重期组织因子(tissue factor，TF)和MCP-1、TGF-β1的水平明显高于正常人，且TF与MCP-1、TGF-β1之间有明显正相关性。由此推测大鼠原代PASMCs合成分泌MCP-1、TGF-β1的水平除了受TLR4的影响外可能还有其他信号途径的参与，但其具体机制目前仍不十分清楚，作者将在接下来的研究中做进一步的探讨。

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(2016-11-27收稿 责任编辑赵秋民)

Detection of MCP-1,TGF-β1 and TLR4 protein in primary pulmonary artery smooth muscle cells of COPD rats

JIANGMing,WANGChangming,HANXuhui,YANGDan,MALibing,CHENFeng,LYUQian

DepartmentofRespiratoryMedicine,GuilinMedicalUniversityAffiliatedHospital,Guilin,Guangxi541001

chronic obstructive pulmonary disease;Toll like receptor-4;monocyte chemoattractant protein 1;transforming growth factor β1;rat

Aim: To probe into the secretion of monocyte chemoattractant protein 1(MCP-1),transforming growth factor β1(TGF-β1) in primary pulmonary artery smooth muscle cells(PASMCs) of chronic obstructive pulmonary disease(COPD) rats and the correlation with toll-like receptor 4(TLR4) signaling pathways. Methods: The COPD rat model was established, and the PASMCs were separated, induced by LPS, and then divided into control group,LPS group,TAK-242 group,and LPS+TAK-242 group. The expression of TLR4 in PASMCs of each group was detected by Western blot, and the concentrations of MCP-1 and TGF-β1 in cell culture fluid were determined by ELISA, and at last a correlation analysis was conducted.Results: In contrast with the control group, the expression of TLR4 in PASMCs of the LPS group was inecreased(P<0.05) and the concentrations of MCP-1 and TGF-β1 in cell culture fluid were increased(P<0.05). The expression of TLR4 in PASMCs of the TAK-242 group was down-regulated(P<0.05) and the concentrations of MCP-1 and TGF-β1 in cell culture fluid showed no correlation with the expression of TLR4.Conclusion: LPS can induce PASMCs of rats to synthesize and secrete MCP-1 and TGF-β1, and the TLR4 is up-expressed at the same time.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.031

R563.3

*国家自然科学基金资助项目 81360010；广西省卫生厅自然科学基金资助项目 S201603

#通信作者，男，1963年11月生，博士，教授，主任医师，研究方向：慢性阻塞性肺疾病，E-mail：wcm@glmc.edu.cn