单侧Ⅱ类牵引对成年大鼠颞下颌关节滑膜的影响*

杨宇虹,杨 扬,李茜茜,陈旻生,张志伟#

1)郑州大学第一附属医院正畸科 郑州 450052 2)郑州大学第二附属医院口腔科 郑州 450014

单侧Ⅱ类牵引对成年大鼠颞下颌关节滑膜的影响*

杨宇虹1),杨 扬1),李茜茜1),陈旻生2),张志伟2)#

1)郑州大学第一附属医院正畸科 郑州 450052 2)郑州大学第二附属医院口腔科 郑州 450014

牵引；颞下颌关节；滑膜；大鼠；白细胞介素-1β；血管内皮生长因子

目的：研究单侧Ⅱ类牵引对成年大鼠牵引侧颞下颌关节滑膜的影响。方法180只8周龄的SD雄性大鼠采用随机数字表法分为3组：A组(实验组)，在右下第一磨牙和右上切牙之间固定Ni-Ti拉簧，加力20 g，建立单侧Ⅱ类牵引模型；B组(假手术组)，同A组固定拉簧，不加力；C组(空白组)，不固定拉簧。每组按时间点(第1、3、7、14、21、28天)处死大鼠，取右侧关节双板区的滑膜组织进行HE染色和IL-1β、VEGF免疫组化染色，观察滑膜的组织学变化，检测IL-1β、VEGF的表达，并分析A组滑膜的病理评分和IL-1β、VEGF表达量之间的关系。结果A组各时间点IL-1β和VEGF的表达均比相应时间点B组、C组高(P<0.001) 。相应时间点A组的病理评分与IL-1β、VEGF的表达呈正相关(r=0.912、0.930，P均<0.001) 。结论单侧Ⅱ类牵引可引起颞下颌关节滑膜发生组织学改变，这种改变与滑膜组织IL-1β、VEGF的表达有关。

颞下颌关节(temporomandibular joint，TMJ)是全身关节中结构和功能最为复杂的关节之一，是口颌系统中的左右联动关节, 两侧的关节在结构、功能和运动方面都对称协调一致。有研究[1]表明，不当的正畸治疗可能与颞下颌关节紊乱病(temporomandibular joint disorder，TMD)的发生存在某些关联，而滑膜炎是正畸引起的TMD常见类型之一。滑膜是TMJ囊内功能性整体的一部分，主要覆盖在双板区的上下面，在维持关节功能方面有重要作用。IL-1β、VEGF是滑膜炎中常见的致炎因子，IL-1β可加重局部炎症反应，破坏关节结构[2-3]；VEGF能维持炎症状态，促进炎症发展，引起滑膜增生等[4]。口内的不对称牵引可通过牙列将力传递至TMJ，成人TMJ代偿能力低，改建缓慢有限，不对称牵引对成熟TMJ滑膜会产生怎样的影响，目前仍不明确。该研究旨在通过观察滑膜的组织学改变及IL-1β、VEGF表达的变化，探讨单侧Ⅱ类牵引对成年大鼠牵引侧TMJ滑膜的影响。

1 材料与方法

1.1材料和仪器Ni-Ti拉簧(北京圣码特科技有限公司)，弹簧测力计(杭州奥杰医疗器械有限公司)，游标卡尺(桂林广陆数字测控股份有限公司)，正畸专用0.25 mm结扎丝(杭州西湖生物材料有限公司)，牙科低速手机(桂林市啄木鸟医疗器械有限公司),兔抗鼠IL-1β一抗、兔抗鼠VEGF一抗(美国Abcam公司),SP试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2动物分组及处理8周龄的SPF级健康SD雄性大鼠180只[山东省实验动物中心提供，许可证号SCXK(鲁)20140007]，230～250 g。适应性喂养1周后，将大鼠采用随机数字表法分为实验组(A组)、假手术组(B组)、空白组(C组)，每组60只。再按时间点(第1、3、7、14、21、28天)将A、B、C组大鼠均分为6个亚组，每个亚组10只。

麻醉前对A组大鼠进行称重，用新鲜配制的70 g/L水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠

翻正反射消失后，固定大鼠的头部和四肢，用自制的牵拉钩牵拉大鼠的口角，暴露其口腔视野，用牙科低速金刚砂车针在大鼠右侧下颌的第一磨牙近中颊轴面角近龈缘处和上颌中切牙远中颊轴面角近龈缘处磨出一深约0.2 mm的浅凹，正畸结扎丝从右侧第一磨牙和第二磨牙邻间隙穿过在浅沟里结扎连接Ni-Ti拉簧的一头，用弹簧测力计在口内施加20 g力，并用游标卡尺测量拉簧拉伸的长度，Ni-Ti拉簧另一头结扎固定在右上中切牙的浅沟里(图1)。在左右上中切牙之间和右下磨牙之间用树脂粘结剂粘结，防止牙移动而导致建模失败。B组同A组，称重、麻醉、固定大鼠，功能位连接固定Ni-Ti拉簧但不加力。C组只在右下第一磨牙及右上中切牙颊轴面角近龈缘处处制备浅凹，不连接Ni-Ti拉簧。每天定时给大鼠称重，并检查口内装置，发现脱落立即重新加载。

图1 单侧Ⅱ类牵引动物模型 建立后大鼠正位(A)、侧位(B)照

1.3取材分别于建模后第1、3、7、14、21、28天，处死各亚组的大鼠，取牵引侧双板区滑膜组织，置于体积分数4%中性甲醛溶液中常规固定。

1.4牵引侧双板区滑膜组织HE染色主要步骤如下：脱水透明、浸蜡、包埋、切片(矢状面，5 μm)、漂片、烤片、脱蜡染色、分化漂洗、脱水和复染、脱水和透明、封片。

由专业医师按以下病理等级标准在400倍镜下读片、评分[5-7]。滑膜衬里层数目：0分，1层；1分，2～层；2分，4～层；3分，5～层。滑膜下层血管数目：0分，<5个/mm2；1分，5～个/mm2；2分，10～个/mm2；3分，15～个/mm2。滑膜下层炎细胞数：0分，<2个/mm2；1分，2～个/mm2；2分，10～个/mm2；3分，50～个/mm2。总病理评分为以上各评分值之和。

1.5牵引侧双板区滑膜组织IL-1β、VEGF免疫组化染色主要步骤如下：脱水透明、浸蜡、包埋、切片(矢状面，5 μm)、漂片、烤片、脱蜡、抗原修复、血清封闭、加一抗、加二抗、加SABC、加显色剂、复染、脱水、封片。

用Biosens Digital Imaging System V1.6图像分析软件对切片中IL-1β、VEGF染色强度进行分析，以牵引侧双板区被覆的滑膜组织为检测对象，每张切片在400倍镜下选取3个检测部位，检测每张切片的光密度值，结果取平均值，作为IL-1β、VEGF的相对表达量。

1.6统计学处理采用SPSS 19.0进行统计学处理。3组大鼠TMJ滑膜IL-1β和VEGF相对表达量的比较均采用3×6析因设计的方差分析；A组大鼠滑膜病理评分与滑膜IL-1β、VEGF相对表达量之间的关系采用Pearson积差相关进行分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1牵引侧双板区滑膜组织HE染色C组滑膜未发生任何改变。B组滑膜衬里层数目在第14、21天有增加，滑膜下层血管数目和炎细胞数先增加后降低，滑膜病理评分与C组比较稍升高。A组的滑膜衬里层数目、滑膜下层血管数目和炎细胞数先增加，后期逐渐减少。见图2、表1～4。

1：C组：2：B组；3：A组；A～F：分别为第1、3、7、14、21、28天。 图2 各组大鼠不同时间点TMJ滑膜的变化(HE,×400)

组别n第1天第3天第7天第14天第21天第28天C组100.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00B组100.00±0.000.00±0.000.00±0.000.20±0.400.10±0.300.00±0.00A组100.00±0.000.60±0.660.10±0.301.00±0.631.40±0.501.20±0.49

表2 各组大鼠TMJ滑膜下层血管数目比较

表3 各组大鼠TMJ滑膜下层炎细胞数比较

表4 各组大鼠TMJ滑膜病理评分比较

2.2牵引侧双板区滑膜组织IL-1β、VEGF免疫组化染色C组IL-1β、VEGF的表达无明显改变，A组和B组IL-1β、VEGF的表达均先升高，达到一峰值后，又逐渐下降。A组和B组IL-1β、VEGF的表达均高于C组，A组IL-1β、VEGF的表达高于B组,差异均有统计学意义。见图3，表5、6和图4。

1：C组：2：B组；3：A组；A～F：分别为第1、3、7、14、21、28天。 图3 各组大鼠不同时间点TMJ滑膜IL-1β的表达(SABC，×400)

组别n第1天第3天第7天第14天第21天第28天C组1032.54±4.3331.75±2.8832.85±4.7330.19±2.9230.96±4.5029.76±1.83B组1036.12±5.90*49.01±4.58*51.59±3.24*45.08±4.23*39.87±2.14*34.18±2.87*A组1079.05±5.60*#111.65±4.91*#126.91±2.68*#97.72±7.25*#84.87±6.00*#70.79±4.26*#

F组间=1 379.049，F时间=46.607，F交互=20.283，P均<0.001；*：与C组比较，P<0.001;#:与B组比较，P<0.001。

表6 各组大鼠TMJ滑膜VEGF表达的比较

F组间=535.985，F时间=39.452，F交互=26.672，P均<0.001；*：与C组比较，P<0.001;#:与B组比较，P<0.001。

1：C组：2：B组；3：A组；A～F：分别为第1、3、7、14、21、28天。 图4 各组大鼠不同时间点TMJ滑膜VEGF的表达(SABC，×400)

2.3A组大鼠TMJ滑膜病理评分与滑膜IL-1β、VEGF相对表达量的相关性分析A组大鼠TMJ滑膜病理评分与滑膜IL-1β、VEGF相对表达量均呈正相关(r=0.912、0.930，P均<0.001)。

3 讨论

咬合、关节、神经肌肉是一个有机的整体，当施加单侧牵引后，稳定的口颌系统肌链状态发生改变，关节肌肉张力的变化直接影响盘-髁复合体在关节囊内的位置和功能，囊内的流体静压升高，持续的高压状态会不断刺激关节腔面的滑膜细胞，使滑膜细胞的表型、代谢和分化等功能发生改变，即为了建立新的平衡，机械信号传递给滑膜细胞，从而使滑膜细胞将机械刺激信号传递至核内，转化为特定细胞应答，促进各种细胞因子的释放，如IL-1β、VEGF，这些细胞因子与关节各种病症的产生有密切的关系[8]。

该研究结果显示，在大鼠口内施加单侧Ⅱ类牵引后，滑膜先发生了轻微的急性炎症反应，主要表现为滑膜下层组织中血管数目增多，血管扩张明显，有炎细胞浸润。随后出现滑膜固有层细胞增生，这可能与牵引使关节滑膜发生了慢性炎症反应有关。随着时间的逐渐推移，滑膜发生了相应的适应性改建，滑膜的炎症反应逐渐消退。IL-1β和VEGF是滑膜组织中重要的细胞因子，该实验中C组的滑膜组织中有IL-1β、VEGF的低水平表达。而A组大鼠在施加单侧牵引后，关节的力学微环境发生改变，通过信号转导，使IL-1β、VEGF超生理量表达。实验初期，随着滑膜炎症反应程度增强，IL-1β、VEGF表达增强，在第7天达到顶峰，之后炎症反应逐渐减轻，IL-1β、VEGF表达也随之减少。说明单侧牵引能引起滑膜一定程度的炎症反应，且严重程度与IL-1β、VEGF表达呈正相关，提示IL-1β、VEGF在滑膜炎症中有重要作用，这与吴庆亭等[9]的观点相似。作者还发现，在一些IL-1β、VEGF高表达区域，血管数目较多，滑膜细胞增生现象常见。该研究结果显示，单侧牵引后，牵引侧双板区滑膜发生的变化依次为：炎症、细胞和基质增生、改建。说明在牵引过程中，滑膜逐渐发生了适应、改建和修复，但最终能否完全恢复至初始状态，关节的生理功能是否受到影响，尚待进一步的深入研究来证实。在B组，滑膜组织也表现出了轻微的炎症反应，IL-1β、VEGF表达也有增加。说明B组虽未加力，但口内的装置仍对滑膜产生了影响，可能是由于口内的拉簧装置使其咀嚼方式发生了改变，进而影响了关节。

TMJ是稳定性和灵活性高度协调的关节，长时间被动过大张口使关节的力学环境适应能力失代偿，会引起各种细胞因子的超表达，诱发关节的无菌性炎症，破坏关节表面的滑膜组织。因此在该研究的造模过程中，牵拉大鼠口角时应注意大鼠的开口度和时间，使开口度<25 mm[10]，熟悉建模技术，缩减被动开口时间，尽可能减少非实验因素对关节滑膜的不利影响。TMJ是一个左右联动的关节，由于实验的局限性，该研究只研究了牵引侧滑膜的变化，而关于牵引对侧的滑膜、不同力值的牵引和牵引去除后滑膜的变化仍需进一步的研究。

综上所述，IL-1β、VEGF参与了滑膜的反应性变化过程，且这种反应性变化有一定的可逆性。

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(2017-02-16收稿 责任编辑姜春霞)

Effects of unilateral class Ⅱ traction on synovial membrane of temporomandibular joint in adult rats

YANGYuhong1),YANGYang1),LIXixi1),CHENMinsheng2),ZHANGZhiwei2)

1)DepartmentofOrthodontics，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052 2)DepartmentofStomatology，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

traction;temporomandibular joint;synovial membrane;rat;IL-1β;VEGF

Aim: To study the effects of unilateral class Ⅱ traction on temporomandibular joint(TMJ) synovial membrane in adult rats.Methods: A total of 180 8-week-old male SD rats were randomly allocated into three groups:group A(experimental group),fixed Ni-Ti spring loaded about 20 grams between the first molar and the upper incisor of right;group B(sham operation group),fixed Ni-Ti spring but not loaded;group C(control group), fixed no spring. Rats of each group were sacrificed at the time points(the 1st,3rd,7th,14th,21st,28th day), then the right synovial tissue of double plate area was prepared,and HE staining and immunohistochemical staining were used to observe the histological changes of synovial tissue and detect the expressions of IL-1β and VEGF, respectively. The relationship between the pathological score and the expressions of IL-1β and VEGF in group A was analyzed.Results: The expressions of IL-1β and VEGF in group A at each time point were higher than those of group B and group C(P<0.001).There was a positive correlation between the pathological score and the expression of IL-1β or VEGF in group A(r=0.912, 0.930,P<0.001).Conclusion: Unilateral class Ⅱ traction could cause histological changes of TMJ synovial tissue.There is a positive correlation between the histological changes and the expression of IL-1β or VEGF.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.017

R783.5

#通信作者，女，1967年1月生，硕士，主任医师，研究方向：口腔正畸，E-mail：Zdeyzzw@163.com

*河南省医学科技攻关计划项目 201503088