抗博尔纳病病毒磷蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

马丽华，邓 榕，徐晓艳，杨宏静，谢 鹏

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.005

抗博尔纳病病毒磷蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

马丽华1,3，邓 榕2，徐晓艳1,3，杨宏静1，谢 鹏3

目的以重组的博尔纳病病毒(BDV)磷蛋白(p24)为免疫原制备单克隆抗体，并鉴定其特异性。方法以纯化后的重组BDVp24免疫小鼠，将骨髓瘤细胞与其脾细胞进行融合，经ELISA法筛选出分泌抗p24单抗的细胞株，并对其进行克隆与亚克隆培养，将最终获得的其中2株细胞株分别注入小鼠腹腔制备单抗，经亲和纯化法纯化后，采用ELISA法测定效价，利用蛋白免疫印迹和免疫荧光鉴定其特异性。结果建立了2株稳定分泌抗p24单抗的杂交瘤细胞株，抗体亚类均为IgG1型。纯化后的腹水抗p24单抗纯度为98%和93%，ELISA 效价在1∶81 000以上,该抗体均能识别重组p24蛋白和BDV感染人类少突胶质细胞(Oligodendroglia cell，OL细胞)所表达的p24蛋白。结论成功制备了灵敏性高、特异性好的抗BDVp24单抗，为博尔纳病病毒诊断方法的研制及感染机理的研讨提供依据。

博尔纳病病毒;磷蛋白类;单克隆抗体

博尔纳病病毒(Borna disease virus, BDV)是博尔纳病毒科博尔纳病毒属的唯一成员，是一种人畜共患病病原体，易感染多数恒温动物，包括人类在内[1]，其感染地域广泛，在全世界均有报道[2]。BDV具有高度的嗜神经性[3]，感染后主要表现为精神、行为异常，称为Borna病。BDV最早于战马中引起致死性脑膜脑炎的暴发流行，而后在双向情感障碍、强迫症患者及精神分裂症患者体内成功分离出BDV[4-5]，许多实验也证明BDV 与人类神经精神疾病密切相关[6-7]。Borna病病死率非常高[8]，目前，治疗Borna病最有效的方法是对症和支持治疗。避免接触病毒来源是预防Borna病唯一的方法，因此建立BDV的实验室检查方法显得尤为重要。

BDV基因组长8 900 bp，其6 个开放式读码框(Open reading frame，ORF)分别编码核蛋白(N，p40)、磷蛋白(P，p24)、基质蛋白(M，p16)、糖蛋白(G，p57)、L-聚合酶(L，P190)和非糖基化蛋白(X，p10)[9]。与其他很多RNA病毒不一样，在不同感染区域、不同感染时间、不同宿主类别及不同病毒株，BDV的核酸序列均具有高度的保守性[10]，其中保守性最大的是ORFⅡ，它编码的p24 蛋白抗原性极强，可能在BDV感染中起重要作用[11]，且p24 蛋白一直处于表达状态[12]，因而，可成为检测BDV的重要诊断指标。单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、重复性好、且能大量制备等特点，广泛应用于免疫组化、酶联免疫吸附试验和放射免疫分析等技术。本研究制备并纯化了特异性抗BDVp24单抗，为博尔纳病病毒诊断方法的研制及感染机理的研讨提供依据。

1 材 料

1.1 实验动物 6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，由重医医科大学实验中心豢养。

1.2 病毒与细胞 OL细胞和BDV由德国HannsLudwig教授赠予；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0购自南京金丝瑞公司;单疱病毒1型(HSV-1 )F株由重庆医科大学神经科学研究中心保存。1.3 主要试剂 重组BDV p24蛋白和重组BDVp40蛋白由本课题组前期制备;弗氏佐剂和PEG4000、Trien-X100购自Sigma ；DMEM培养液和PBS购自HyClone；荧光标记的羊抗鼠IgG、HRP标记的羊抗鼠IgG 、pNPP显色液和TMB购自上海生工;蛋白marker购自Fermentas公司;聚偏二氟乙烯膜购自Millipore公司;NaOH和4%多聚甲醛为国产分析纯；HisTrapTM亲和柱购自GE公司。

2 方 法

2.1 动物免疫 将重组BDV p24蛋白作为免疫原，选取5只SPF级6～8周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫。初次免疫时，每只小鼠的免疫剂量是100 μg，p24蛋白与弗氏完全佐剂1∶1乳化均匀，注射入小鼠腹腔。2周后进行第2次免疫，免疫剂量50 μg/只，使用弗氏不完全佐剂进行乳化，腹腔注射。21 d后采用相同的方法进行第3次免疫。7 d后取尾静脉血用ELISA法测血清中抗体效价，选取效价水平达到要求的小鼠，2周后不加佐剂进行最后一次加强免疫，3 d后取脾细胞。

2.2 杂交瘤细胞株的建立 将冻存的骨髓瘤细胞SP2/0复苏后，培养于37 ℃含 5% CO2的培养箱中，选择存活率高且处于对数生长期的细胞进行后期融合。融合前1 d取SPF级小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，培养于96孔板中。融合当天将骨髓瘤细胞SP2/0和加强免疫后取的小鼠脾细胞按1∶5的比例，在50%PEG4000的作用下进行融合，用 HAT 培养液重悬加到预先准备好的饲养细胞板中，于37 ℃ 5% CO2中培养。

观察杂交瘤细胞生长情况，用ELISA法检测其上清，筛选出分泌抗p24单抗的阳性孔。用有限稀释法对筛选得到的阳性孔进行克隆，再用ELISA法对细胞培养上清进行检测，对阳性孔再进行亚克隆，直至阳性孔为 100%。

2.3 单克隆抗体亚类鉴定 使用SBA公司抗体亚类测定试剂对分泌的单克隆抗体进行亚类的鉴别。

2.4 单克隆抗体的腹水制备与纯化 将液体石蜡以0.5 mL/只注入经产BALB/c小鼠腹腔，1周后再将处于对数生长期的杂交瘤细胞按每只小鼠1×106个细胞的量注入小鼠腹腔。约 7～10 d后，小鼠的腹腔极度膨胀时采集腹水，进行离心取上清，分装后冻存。将制备的腹水单抗采取protein G亲和纯化法纯化，经SDS-PAGE和ELISA检测后分装于-20 ℃保存。

2.5 腹水型单克隆抗体纯化后效价的测定 将重组BDV p24蛋白用PBS(pH7.4)包被缓冲液稀释至10 μg/mL，酶标板每孔加入 100 μL稀释液，37 ℃孵育2 h。用300 μL洗涤液(含 0.9% NaCl，0.05% Tween-20，0.02% 叠氮化钠)洗涤3次，每孔加300 μL封闭液于37 ℃孵育1 h。用300 μL洗涤液洗涤3次后，每孔加入100 μL从 1∶1 000起用PBS(pH7.4)按3倍梯度递增稀释的腹水抗体， 37 ℃孵育1 h。用300 μL洗涤液洗涤4次，每孔加入100 μL 1∶25 000稀释的HRP 标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h。洗涤液洗涤4次，每孔加入pNPP显色液100 μL，避光反应约10 min。最后加入3 mol/L的NaOH 50 μL，测出A450值。

2.6 单克隆抗体特异性的鉴定

2.6.1 蛋白免疫印迹分析 将OL细胞培养于含5% CO237 ℃培养箱内，当细胞密度达 90%时，按细胞数和病毒数1∶1接种BDV，换液传代培养15 d。待细胞长满单层时，洗涤3次后用含PMSF的裂解液裂解细胞30 min，于4 ℃，12 000 r/min离心5 min，分别收集感染BDV和正常OL细胞的蛋白。将收集到的蛋白与重组BDVp40蛋白和p24蛋白各取50 μg，煮沸5 min后，12 000 r/min离心1 min,分别取2μL上清，经SDS-PAGE分离蛋白，电转移至聚偏二氟乙烯膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗抗p24单抗孵育2 h，洗涤3次，加入二抗HRP标记的羊抗鼠IgG孵育2 h，洗涤3次，用ECL 发光试剂盒发光，凝胶成像照相。

2.6.2 免疫荧光分析 6孔板用4%多聚赖氨酸包被，培养正常OL细胞和感染BDV的OL细胞，每组3个孔，培养于含5% CO237 ℃的培养箱中。细胞铺满瓶底时，PBS洗涤5 min，重复3次，加入4%多聚甲醛，15 min后弃之，加入0.2%Trien-X100裂解细胞膜，室温下孵育10min。洗涤3次，加入5%脱脂奶粉溶液，1 h后加入纯化的抗p24单抗，4 ℃孵育过夜,37 ℃复温40min。PBS洗涤3次，避光加入荧光标记的羊抗鼠IgG，于37 ℃温箱作用1 h。PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察。用HSV-1感染OL细胞，重复上述步骤。

3 结 果

3.1 免疫小鼠血清抗体效价的测定 第3次免疫后的第7 d用ELISA法测小鼠血清中抗体的效价，5只小鼠的血清抗体效价均在1∶27 000以上，满足细胞融合要求。选择健康状况最好、效价较高的4号和6号小鼠进行加强免疫。

3.2 杂交瘤细胞株的筛选与克隆 细胞融合后，用ELISA筛选出OD值高且团小的杂交瘤细胞株，采用有限稀释法进行克隆及3次亚克隆，获得稳定分泌抗BDVp24单抗的杂交瘤细胞株3株。以骨髓瘤细胞SP2/0上清为阴性对照，采用间接 ELISA 法检测其培养上清单抗的效价为1∶2 430以上(表1)。选取3E9B2和3B10A4杂交瘤细胞株进行冻存，复苏后培养，细胞生长良好，传20 代以上，都能稳定分泌抗BDVp24单抗。

表1 细胞培养上清抗BDVp24单克隆抗体效价
Tab.1 Titer of BDV p24 monoclonal antibody in cell culture supernatant

Dilutedtimes1∶101∶301∶901∶2701∶8101∶2430NegativeTiter3E9B21.8831.8171.7121.5451.1931.0850.082>1∶24303B10A42.2091.4310.8520.8420.8260.5830.082>1∶24301A6G111.8011.7841.6111.3320.740.2580.082>1∶2430

3.3 单克隆抗体亚类的鉴定结果 通过单克隆抗体亚类鉴定分析得出IgG1的OD值均明显高于其他亚类的OD值，所以本实验获得的抗BDVp24单抗的抗体亚类均为IgG1，轻链为K。

3.4 腹水型单克隆抗体纯化后SDS-PAGE结果 将杂交瘤细胞3E9B2和3B10A4分别注入小鼠腹腔产生的抗BDVp24单克隆抗体纯化后SDS-PAGE结果如图1所示，纯化效果良好纯度分别达到了 98%和93%。

3.5 腹水型单克隆抗体纯化后效价测定结果 小鼠腹腔注射3E9B2和3B10A4杂交瘤细胞产生的抗BDVp24单克隆抗体纯化后，其效价经ELISA法检测均在8.1×104以上(表2)。

图1 腹水单克隆抗体的SDS-PAGE图Fig.1 SDS-PAGE of purified monoclonal antibodies from ascites

表2 腹水型单克隆抗体纯化后ELISA结果
Tab.2 Titer of purified monoclonal antibody in ascites

3.6 腹水型单克隆抗体纯化后特异性的鉴定

3.6.1 蛋白免疫印迹分析 蛋白免疫印迹实验显示，以纯化抗p24单克隆抗体作为一抗，感染BDV的OL细胞和重组p24蛋白处有明显特异的条带，而正常OL细胞和重组p40蛋白处无条带 (图2)。表明制备的抗p24 单抗不仅可特异性结合BDV重组p24蛋白,且能特异性结合细胞所表达的p24 蛋白，特异性好。

1: recombinant p24; 2: OL cells infected with BDV; 3: normal OL cells; 4: recombinant p40图2 抗BDVp24单抗的蛋白免疫印迹分析结果Fig.2 Western blot analysis of BDV p24 monoclonal antibody

3.6.2 免疫荧光分析 以纯化后的抗p24单抗为一抗，荧光标记的羊抗鼠IgG为二抗，荧光显微镜下，感染BDV的OL细胞发出明显的绿色荧光，而感染HSV-1的OL细胞和正常的OL细胞无荧光信号。说明抗p24单抗能特异地结合细胞所表达的p24蛋白，特异性好(图3)。

4 讨 论

BDV宿主种类多，感染地理分布广，病死率高，为预防BDV可能引发的爆发流行，建立该病毒的实验室检查方法显得尤为必要[13]。另有研究者提出，虽然BDV有着广泛的宿主，但马、绵羊外的动物感染后发病率较低，认为临床上易误诊及漏诊[14]，因此需要建立高灵敏度和特异性的诊断方法。

A: OL cells infected withHSV-1; B: OL cells infected with BDV; 3: normal OL cells图3 抗p24单抗的免疫荧光分析结果(SP染色，×200)Fig.3 Immunofluorescence analysis of monoclonal antibody (SP staining, ×200)

病毒检测公认的金指标是病毒分离的，但病毒分离方法较复杂且敏感性较低，而BDV感染时病毒颗粒较少，且为非溶细胞性感染，不易分离[5]。快捷、简单、特异和敏感是血清免疫学检测方法的优点，可作为诊断 BDV感染的一种重要方法。

在机体感染过程中p24蛋白持续表达，且抗原性较强[13]，所以，在本实验中我们以前期制备并纯化的p24蛋白(纯度>85%)为免疫原制备抗BDVp24单抗[15]。本研究选取雌性的6～8周龄Balb/c小鼠，经3次免疫后小鼠血清抗体效价达万时，采用腹腔注射加强免疫后3 d取脾细胞与对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，通过间接ELISA法反复筛选，通过有限稀释法克隆，最后获得3株稳定分泌抗BDVp24单抗的细胞株，且抗体亚类均为IgG1型。2株单抗3E9B2和3B10A4的小鼠腹水纯化后 ELISA 效价在1∶81 000以上，灵敏度较高。免疫荧光与蛋白免疫印迹分析显示，制备并纯化的抗BDVp24单抗不但能与重组p24蛋白发生特异性结合，而且能与BDV感染的OL细胞所表达的p24蛋白发生特异性结合。

综上所述，本实验顺利制备了灵敏度高、特异性好的抗BDVp24单抗，为博尔纳病病毒诊断方法的研制及感染机理的研讨提供依据。

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PreparationandidentificationofmonoclonalantibodyagainstphosphoproteinofBornadiseasevirus

MA Li-hua1, DENG Rong2, XU Xiao-yan1,3, YANG Hong-jing1, XIE Peng3

(1.DepartmentofBasicMedicine,ChongqingThreeGorgesMedicalCollege,Wanzhou404120,China;2.DepartmentofNeurology,ChongqingThreeGorgesCenterHospital,Wanzhou404120,China;3.InstituteofNeuroscience,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

In order to prepare the monoclonal antibodies (MAbs) by the recombinant phosphoprotein (p24) of Borne disease virus (BDV) as immunogen, the spleen cells of immunized balb/c mice with the recombinant BDV p24 were fused with the myeloma cells SP2/0. The hybridoma cell lines secreting MAbs against p24 were obtained after selected by indirect ELISA and subcloned for 3 times. The MAbs were prepared by intraperitoneal injection in mice, purified by affinity chromatography, identified by western blot and immunofluorescence assay (IFA) for specificity. The purified MAbs against BDV p24 from ascites belonged to IgG1 showed a purity of 98% and 93%, and a titer of 1∶81 000, and specific reaction with the BDV p24 restructured and expressed in Oligodendroglia cells (OL). The MAbs against BDV p24, with high specificity and sensitivity, were prepared successfully, which laid a basis for the study of diagnostic reagents and pathogenic mechanism of BDV.

Borna disease virus (BDV); phosphoproteins; monoclonal antibody

Xie Peng, Email: xiepeng58@21cn.com

谢鹏，Email：xiepeng58@21cn.com

1.重庆三峡医药高等专科学校基础医学部，万州 404120；

2.重庆三峡中心医院神经内科，万州 404120；

R392

：A

：1002-2694(2017)09-0779-05

2017-02-14编辑：刘岱伟

国家重点基础研究发展计划(973 计划，No.2009CB918300)

3.重庆医科大学神经科学研究中心，重庆 400016

Supported by the National Basic Research Program of China (973 Program, Grant No. 2009CB918300)