GPR78与ETS1基因交互作用与系统性红斑狼疮的相关性研究

后俊生 张学军

·论著·

GPR78与ETS1基因交互作用与系统性红斑狼疮的相关性研究

后俊生1张学军2,3,4

目的： 明确GPR78和ETS1基因的交互作用对系统性红斑狼疮(SLE)发病的影响。方法：在前期GWAS的基础上，选择可能存在共同生物学效应的GPR78(SNP rs3103074)和ETS1(SNP rs6590330)，在中国汉族人群4199例SLE和8255名对照中基因分型。通过logistic回归模式检验这两者之间可能存在的交互作用。结果： GPR78和ETS1基因在中国汉族人SLE发病中存在显著的交互作用(Pcombined=1.4×10-4,OR=1.27)。单个SNP与SLE的关联性分析发现GPR78(SNP rs3103074)是提示点(P=6.2×10-4,OR=1.22,95%CI:1.12～1.32)，与SLE中度关联。结论： GPR78与ETS1基因之间存在着显著的交互作用，可能在SLE的发病中发挥作用。

系统性红斑狼疮； ETS1； GPR78； 交互作用

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一个自身免疫性疾病，以累及多器官、多系统、产生自身抗体为特征。其发病机制目前认为和遗传、环境、雌激素等因素相关。其中遗传因素是一个主要的致病因素[1]，随着全基因组关联研究(Genome-wide Association Study，GWAS)在寻找疾病易感基因上的应用，找到了至少30多个明确的，与SLE关联显著的易感位点和基因，比如TNFAIP3、ETS1、TNIP1、BLK、ITGAM等[2-6]。但是这些基因或位点只能解释不到15%的遗传风险[7]。复杂疾病的致病往往是由很多基因或位点共同作用所致，一些位点或基因的作用很弱，它们对疾病的贡献很弱，被称为微效基因，在GWAS单点分析中容易被忽略。许多微效基因的作用可以累积起来产生累加效应，进而形成较为明显的性状，要寻找到这些缺失的遗传，基因与基因之间的交互作用研究是一个很好的方法。基因与基因交互作用由Fisher首次定义，也称上位性作用，是对不同基因互相叠加后对疾病表型表达影响的一种分析[8],基因与基因之间的交互作用可用来补充说明疾病的遗传性。前期GWAS结果提示GPR78 rs3103074与SLE可能相关(图1)。GPR78是G蛋白偶联受体家族中的一员[9]，GPRs是迄今为止发现的最大的受体超家族，介导很多的生物学效应，G蛋白偶联受体相关的信号通路有cAMP/PKA, IP3/DAG这两个信号通路。考虑这个基因在细胞中可能发挥的功能，被选出来做进一步的交互作用研究。 ETS1 rs6590330这个点在不同的研究小组中均被报道和SLE显著相关[3,10]。ETS-1是ETS转录因子家族中的一员，有特有的ETS DNA结合区域，它们调控了很多的细胞进程，包括细胞增殖和细胞分化，ETS1是多个基因的转录激活因子[11]，故而被选出来做交互作用的研究。本研究利用SLE的前期GWAS数据，分析GPR78和ETS1基因交互作用对SLE发病的影响。

SNP rs3103074(大红色钻石性状)在4p16.1上，位于GPR78基因上游大约19.6 kb。物理位置是8613568 bp，在8613～8633 kb大约200 kb的这个连锁不平衡区域内，只包含GPR78一个基因，所以SNP rs3103074这个点对应到这个基因

图1 LD结构和4p16.1区域关联结果

1 资料与方法

1.1 研究对象 所有SLE的病例和对照样本均从全国各地的医院收集而来，均系汉族人群。初筛阶段使用样本量是1047例SLE患者和1205名对照；验证样本根据地域分布分成2个验证人群(来自中国中部的1643例SLE患者和5930名对照；来自中国南部的1509例SLE患者和1120名对照)。病例共计4199例(男312例，女3887例，平均年龄34.12岁，平均发病年龄29.65岁)，对照组共计8255例(男3817例，女4438例，平均年龄30.74岁)。研究对象之间无血缘关系，并且病例与对照之间经过性别和年龄匹配。所有患者均符合SLE的诊断标准，参考1997年美国风湿病学会修订的诊断标准，经过两位副主任医师以上的专家确诊。所有病例均使用统一的调查表，所有正常对照样本均为健康人，排除SLE、其他自身免疫性疾病和其他系统性疾病，以及排除自身免疫病家族史(包括一、二、三级亲属)。所有研究对象均签署了知情同意书，该项研究经过安徽医科大学伦理委员会同意，按照赫尔辛基宣言的条款执行。

1.2 SNPs的选择 用于交互作用研究SNPs的选择是建立在之前SLE的GWAS基础上，ETS1 rs6590330这个点在不同的研究小组中均被报道和SLE显著相关[3,10]。前期GWAS结果提示GPR78 rs3103074与SLE可能相关(图1)。为进一步研究这两者在SLE发病中所起的作用，选取前期GWAS数据库中这两个SNPs位点的相关数据进行分析，做交互作用研究。

1.3 统计学方法 使用PLINK1.07计算P值，OR值，95%置信区间，等位基因频率估算及差异使用卡方检验，SNPs之间的交互作用在Epistasis部分完成。使用以性别和年龄做为协变量的logistic回归分析研究SNPs之间的交互作用及每个SNP与SLE的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNP rs3103074和rs6590330的关联分析结果 基因关联研究发现GPR78 rs3103074与SLE呈现中度的关联性(P=6.2×10-4,OR=1.22, 95%CI1.12～1.32)见表1。将这个SNP做基因分型，GG、AG和AA，在病例与对照人群中分别计算出这三个基因型的比例，发现GG这个基因型在患者人群中的比例小于正常人群，AA和AG这两个基因型在患者人群中比例大于正常对照人群，所以AA和AG这两个基因型是风险基因型。使用风险的基因型比非风险的基因型，得到OR值，使用logistic回归分析计算这些基因型P值，结果发现AA和AG这两个基因型均会导致SLE的发病风险增加,相应P值和OR值分别是P=0.00014,OR=1.63和P=0.0075,OR=1.20,见表2。在之前的GWAS数据中显示，SNP rs6590330与SLE呈现出显著的相关性(P=1.77×10-25,OR=1.37,95%CI1.29～1.45)[3]。将这个SNP做基因分型，发现AG和AA在患者中的比例大于在正常对照中的比例，GG在患者中的比例小于正常对照，所以AG和AA是风险基因型。同样使用上述方法计算出P值和OR值，发现AA基因型显著增加SLE的发病风险(P=0.019,OR=1.84),见表2。

表1 rs3103074与SLE的相关性分析

注：OR和P值使用线性logistic回归模式计算，校正了性别、年龄。A1：最小等位基因；A2：主要等位基因；F_A：病例中此等位基因频率；F_U：对照中此等位基因频率；OR:优势比，对于A1来说，A2是参照；CI：置信区间

2.2 交互作用的分析 在初筛阶段，发现GPR78 rs3103074和ETS1 rs6590330 这两个基因之间存在着显著的交互作用(PGWAS=1.4×10-2,OR=1.43)，验证之后再联合的样本中交互作用更显著(Pcombined=1.36×10-4,OR=1.27)。本次研究做了基因型的交互作用，四种不同的交互模式下，发掘这两个SNPs之间更深层次的交互作用。在四种交互模式下发现，rs3103074-AA或AG和rs6590330-AA存在着显著的交互作用(P=0.005),rs3103074-AA或AG和rs6590330-AA或AG存在着更显著的交互作用(P=0.0003),见表2。

注：OR和P值使用线性logistic回归模式计算，校正了性别、年龄。交互作用的分析建立在这样一个假设的基础上：这两个SNPs无任何的交互作用，比如协同效应，拮抗效应等

3 讨论

SLE是一个复杂的自身免疫性疾病，临床和试验依据显示SLE是一个典型的多因子疾病，如数目众多的基因、环境、压力和医疗因素等。然而复杂疾病的遗传并不遵循孟德尔的遗传模式，受到很多基因与环境因素的影响。为进一步探索基因与基因之间的交互作用在SLE发病中的影响，本研究建立在前期GWAS基础上，对发现的相关基因做进一步的交互作用的研究。

GPR78目前只发现在人类的脑垂体和胎盘上表达[9]，雌激素与SLE发病相关，雌激素会使NZB/NZW小鼠病情加重[12]，妊娠会诱发或加重SLE患者的病情，而终止妊娠会减轻SLE患者的病情。因此，GPR78可能在妊娠和下丘脑-脑垂体-性腺轴中起到调节作用，继而推测GPR78可能通过调节下丘脑-脑垂体-性腺轴进而调节雌激素的生成或分泌，从而影响到SLE患者的病情。

本研究最主要的发现是GPR78和ETS1这两个基因之间存在着显著的交互作用， GPR78和ETS1这两个基因可能介导着相同的信号通路。GPR78是G蛋白偶联受体超家族中的一员[9]，当配体与G蛋白偶联受体结合后，激活质膜上的磷脂酶C(PLC-β)，使质膜上4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解成1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG)两个第二信使，IP3与内质网上的IP3受体(IP3R)结合，触发IP3R介导的钙通道(IP3R/Ca++)，使胞内Ca2+浓度升高，从而引起不同的生物学效应[13]。在小鼠不成熟的CD4 T细胞里表达三种受体，分别是IP3R1，IP3R2，IP3R3。表达IP3R3这个受体的基因受到转录激活因子ETS-1调节[14]，因此推测GPR78和ETS1这两个基因在IP3R/Ca++这个信号通路上存在着某种联系。IP3R/Ca++这个通道的激活抑制了CD4 T细胞IL-17的表达[16]，IL-17在SLE患者中表达异常增高，在SLE患者血浆中的浓度异常增高[15]。IL-17与SLE的疾病严重性和活动性相关[16,17]。IL-17在SLE患者中的异常增高表达主要是由于双阴性CD4 T细胞亚型和CD4+T细胞的过度表达造成[18]。所以以上这些证据表明IP3R/Ca++这个通道可能是通过上调IL-17的表达参与SLE的疾病发病。

综上所述，本研究发现了GPR78这个基因与SLE相关联，且和ETS1基因存在着显著的交互作用。这两个基因可能通过IP3R/Ca++信号通路在SLE的发病中共同发挥效应，导致SLE的发病或加重。GPR78这个基因的功能还不清楚，暂时还不能从基因功能的角度揭示这个基因和SLE的关联性。本研究有助于进一步了解SLE的发病机制，为研发更高效安全的药物提供基础，但这些结果应用临床尚需更多的研究。

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(收稿：2017-04-17 修回：2017-06-24)

InteractionsbetweenGPR78andETS1geneassociatewithsystemiclupuserythematosus

HOUJunsheng1,ZHANGXuejun2,3,4.

1.DepartmentofDermatology,NanjingLishuiPeople'sHospital,Nanjing211200,China; 2.DepartmentofDermatology,TheFirstAffiliatedHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China; 3.InstituteofDermatology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China; 4.KeyLaboratoryofDermatology,MinistryofEducation,Hefei230032,China

ZHANGXuejun,E-mail:ayzxj@vip.sina.com

Objective: To determine the potential effects of the interaction of GPR78 (rs3103074) and ETS1 (rs6590330) on systemic lupus erythematosus (SLE).Methods: Based on our previous GWAS of SLE, GPR78 (SNP rs3103074) and ETS1 (SNP rs6590330) (maybe have an interaction in the pathogenesis of SLE) were chosen. In total, 4199 patients and 8255 controls from Chinese Han population were genotyped for GPR78 rs3103074 and ETS1 rs6590330. Pair-wise interactions between SNPs were evaluated from likelihood ratio tests utilizing logistic regression models.Results: A significant interactive effect between GPR78 rs3103074 and ETS1 rs6590330 on SLE susceptibility (Pcombined=1.4×10-4,OR=1.27) was found through logistic regression analysis. GPR78 rs3103074 was suggestive of SNP, showed medium association with SLE (Pcombined=6.2×10-4,OR=1.22, 95%CI:1.12-1.32) through single SNP association analyses.Conclusion: There is a significant interaction between gene GPR78 and ETS1, which may play a role in the pathogenesis of SLE.

SLE; ETS1; GPR78; interaction

1南京市溧水区人民医院皮肤科，江苏南京，211200 2安徽医科大学第一附属医院皮肤科，安徽合肥，230032 3安徽医科大学皮肤病研究所，安徽合肥，230032 4皮肤病学教育部重点实验室，安徽合肥，230032

张学军，E-mail：ayzxj@vip.sina.com