猪细小病毒感染PK-15细胞后TLRs转录时相的变化

周 雍， 靳晓慧， 李炳晓， 景亚星， 韩 丽， 张利卫，2， 魏战勇

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002; 2.河南省动物性食品安全重点实验室，河南 郑州 450002)

猪细小病毒感染PK-15细胞后TLRs转录时相的变化

周 雍1,2， 靳晓慧1,2， 李炳晓1,2， 景亚星1， 韩 丽1， 张利卫1，2， 魏战勇1,2

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002; 2.河南省动物性食品安全重点实验室，河南 郑州 450002)

研究猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)感染猪肾传代细胞(PK-15 cells)后Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)表达水平变化情况，为探明PPV感染机制提供理论基础。试验利用荧光定量PCR方法检测PPV感染PK-15细胞后TLR1-10的转录时相变化。结果显示，PPV感染PK-15细胞后，TLR1在PPV感染后3h表达上调，约为对照组细胞的3.1倍，其他时段均低于正常水平；TLR3和TLR7 mRNA表达水平在病毒感染早期均低于正常水平；TLR4和TLR8的mRNA含量均在感染后3、12、36 h表达上调，TLR10分别在在3h和36 h表达上调，其他时段均不同程度的降低；而TLR2和TLR9 mRNA表达水平在感染后24 h开始升高，并于48 h达到峰值，分别为对照水平的10.1倍和26.7倍。研究表明,PPV感染PK-15细胞后能够诱导细胞上TLR2和TLR9 在mRNA水平显著上调,PPV感染可能通过TLR2和TLR9受体介导感染。

猪细小病毒；Toll样受体；PK-15细胞；转录时相

猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍为主要特征的重要病原体之一，与其他病原混合感染率极高，增强其他病原的感染性，给养猪业造成了严重的经济损失[1-2]。目前，该病在欧洲、美洲、亚洲的多个国家均有流行，中国已先后在北京、上海、吉林、黑龙江、四川和浙江等地分离到该病毒，血清学调查阳性率为80%[3]。目前对于其感染致病机制了解甚少，特别是通过何种受体介导感染更是不甚了解。Toll样受体 ( Toll-like receptor, TLR )是TLRs家族的重要成员之一，可以通过识别病毒的单链RNA(ssRNA)诱导机体表达干扰素α(IFN-α)和白细胞介素12(IL-12)等细胞因子,对病毒做出相应的免疫应答。其中,TLR2识别范围较广， 可识别大部分现已发现的病原体相关分子模式 (Pathogen-Associated Molecular Pattem, PAMP)结构,TLR1和TLR6作为辅助受体同TLR2组成异二聚体发挥作用[4]。TLR3参与对病毒感染细胞后复制产生dsRNA的识别[5]。TLR4 可识别病毒的包膜蛋白，促进释放β干扰素( interferon β，IFN-β) 及多种细胞因子和炎性介质，介导抗病毒免疫反应，并参与致病[6]。TLR5主要识别大多数杆菌都具有的一个可溶性因子鞭毛蛋白。TLR7、TLR8主要识别多种小分子抗病毒化合物以及病毒的ssRNA[7]。TLR9介导对细菌DNA CpG序列的识别[8]。到目前为止，已有13种TLR被发现。猪体内存在10种TLR，即TLR1～TLRl0，除TLR8外，其余猪TLRs的完整编码序列都已清晰[9]。Toll样受体是一个庞大的I型跨膜受体蛋白家族，TLR3、TLR7、TLR8、TLR9都是介导病毒免疫的重要受体。LUND等[10]用基因敲除技术研究TLR9是否介导了HSV-2诱导IFN-II分泌,结果显示这个过程需要TLR9介导。KURT-JONES等[11]发现呼吸道合胞病毒(RSV)的一些融合蛋白能诱生促炎症细胞因子,与正常对照小鼠比较,RSV在TLR4缺陷小鼠中的复制量更多且持续时间更长,提示TLR4能促进机体对病毒的清除。因此，对动物体内的TLRs进行准确定量，可更好地了解动物机体通过免疫应答抵抗病毒感染的致病机制[12]。本试验利用SYBR Green I实时定量PCR 检测方法，分不同时间点定量检测PPV感染PK-15细胞后Toll-like受体1～10的mRNA的水平变化[13]，为研究猪细小病毒的感染机制提供基础数据和依据，并为预防和控制猪细小病毒的感染奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 细胞和病毒 猪肾细胞PK-15(Porcine Kindney-15 cells)细胞购买自中国兽药监察所，并由河南省动物性食品安全重点实验室传代保存；猪细小病毒李氏毒株，病毒滴度为10-6.5·(0.1 mL)-1，由河南省动物性食品安全重点实验室传代保存。

1.1.2 主要仪器 台式离心机(Sigma, Germany)； PCR 仪(Thermo, America)；CFX96 Real-Time PCR 仪(Roche, Switzerland)；紫外凝胶成像系统(SIM, America)； LEICA DMIL 倒置显微镜(Leica, Germany)；CO2培养箱(Thermo, America)。

1.1.3 主要试剂 E.Z.N.A Total RNA KitⅠ(OMEGA)；HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(康为世纪公司)；RPMI Medium 1640(Solarbio)；胰蛋白酶-EDTA消化液(Solarbio)；DEPC水(Sigma, America)；SYBR®Premix Ex Taq TMII(TaKaRa, Japan)；胎牛血清(Hyclone, America)；琼脂糖(Promega, America)；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.1.4 工作液配制 10%细胞培养液：450 mL的RPMI-1640培养液中加入50 mL的胎牛血清，混匀后4 ℃保存备用。

2%细胞维持液：196 mL的RPMI-1640培养液中加入4 mL的胎牛血清，混匀后4 ℃保存备用。

D-Hank’s液：NaCl 8 g，葡萄糖1 g，KClO34 g，NaHCO30.35 g，Na2HPO4·12H2O 0.152 g，KH2PO40.06 g，溶于900 mL ddH2O中，定容至1 000 mL，高压灭菌20～30 min，4 ℃保存备用。

1.2方法

1.2.1 PK-15细胞的培养和PPV病毒的增殖 按常规细胞培养方法[14]，用1640培养液加10%胎牛血清作为PK-15细胞的培养液，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养，直至PK-15细胞生长状态稳定方可进行后续试验。

传代培养细胞，待PK-15细胞培养至80%时，加入适量PPV病毒后继续置于5% CO2培养箱中吸附，吸附1～3 h后，加2%的细胞维持液继续培养24～48 h，待贴壁细胞80%发生病变时，将细胞瓶置于-20 ℃冰箱冷冻，再于室温下融化，如此反复冻融3次细胞全部脱落，吸至离心管中，离心除去细胞碎片后于-80 ℃保存备用。

1.2.2 病毒半数细胞感染量(TCID50)的测定 用2%的RPMI-1640培养液在1.5 mL离心管中10倍倍比稀释PPV病毒液(稀释度为10-1～10-7)，将稀释好的病毒接种于96孔细胞培养板，每个稀释度各作8个重复孔，每孔100 μL，设一列正常细胞对照。逐日观察细胞病变并记录结果，按照Karber法计算TCID50。

1.2.3 病毒感染和样品收集 将PK-15细胞用胰酶消化后，接种于于6孔细胞培养板，待细胞贴壁面积达到80%以上时，用D-hank’s洗2次，将PPV接种于PK-15细胞30 μL(MOI=1)，每孔做2个重复，另设2孔作对照。将6孔板置于5% CO2培养箱中吸附2 h后，弃液体，添加1.5 mL 2%的细胞维持液，继续培养。分别于感染后0、1、3、6、12、24、36、48、72 h用显微镜观察并记录细胞状态，之后对样品进行收集。收集样品时吸取上清于EP管；再次加1.5mL 2%细胞培养液，反复冻融2次，吹打均匀，吸入EP管中，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 RNA提取和反转录 参照 E.Z.N.A Total RNA KitⅠ说明书提取细胞总RNA，具体方法和步骤参照文献[15]进行 ，以提取的总RNA为模板进行反转录，反转录合成的cDNA作为荧光定量PCR模板。

1.2.5 荧光定量PCR 参照GenBank公布的猪TLR1～TLR10序列，使用Primer Premier 5.0软件设计引物(如表1)，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以β-actin基因为内参基因，进行相对荧光定量PCR，反应体系为20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物(25 pmol·L-1)各0.35 μL，cDNA (1 000 ng· μL-1) 2 μL，RNsae Free ddH2O 7.3 μL。反应条件为：95 ℃,30 s；95 ℃,5 s；55 ℃,30 s；72 ℃,30 s；共进行45个循环；循环结束后升温至95 ℃，10 s，再降至65 ℃持续60 s，递增至95 ℃, 1 s，采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，于37 ℃,30 s后结束反应。

表1 Real-time PCR引物及其反应条件Table 1 Primers and conditions used for Real-time PCR assays

1.2.6 数据分析 在荧光定量PCR中，循环阈值(Ct)是反映模板中目标基因含量的重要指标，通过比较目标基因和内参基因β-actin，消除样品收集和加样操作过程中的误差。采用 2-△△Ct法分析数据。试验数据用SPSS软件进行处理分析，采用Duncan法进行检验差异性。

2 结果与分析

2.1PPV感染PK-15后对细胞形态的影响

根据试验结果计算TCID50，PPV病毒滴度为10-5.5·mL-1，待细胞生长至80%时用PPV感染PK-15细胞(MOI=1)，37 ℃吸附后换维持液，并设未接毒细胞对照。于显微镜下记录细胞生长形态(图1)，发现当感染PPV后6 h，显微镜下未见明显形态学变化；感染24 h后，可以看到明显的病变；48 h后随着细胞的增殖，对照组细胞密度增加，逐渐开始变圆，感染组细胞病变达到60%以上，病变细胞聚缩成团状，并伴有明显的多层重叠状态，细胞脱落呈空斑状；到60 h时，对照组细胞几乎铺满底部，接毒组出现明显的聚集、裂解等病变现象，细胞病变区域达到100%，并且大面积脱落。

2.2PPV感染PK-15细胞后TLR1～TLR10的mRNA转录情况

PPV感染PK-15细胞后，在0、1、3、6、12、24、36、48、72 h收集细胞，提取细胞RNA，进行荧光定量PCR，与β-actin进行比较分析，得出不同时段细胞内TLR1～TLR10的表达量(图2)。通过荧光定量PCR，发现在各时段感染组和未感染组均有TLR1～TLR10的转录。其中，TLR1 mRNA水平在PPV感染后3 h约为正常水平的3.1倍，其他时段均低于正常水平。在病毒感染后12 h时,TLR2 mRNA表达量开始升高，约为对照组1.8倍，48 h差异达到峰值，约为对照组的10.1倍。TLR3和TLR7 mRNA表达水平在病毒感染早期均低于正常水平，TLR3在60 h和72 h高于正常水平，TLR7在36 h和72 h高于正常水平。TLR4和TLR8均在3、12、36 h较正常水平发生上调，其他时段mRNA表达水平低于正常水平。TLR5在感染后1、3、36 h较正常水平上调，TLR6在病毒感染后3 h达到峰值，约为正常水平的3.8倍。PPV病毒感染后TLR9 mRNA表达量在24 h开始高于对照组，于48 h相对表达量达到峰值，约为对照组的26.7倍，持续到72 h均发生显著上调。其中60 h和72 h分别为正常水平的13.4倍、1.25倍。TLR10 mRNA转录水平在感染后3 h和36 h发生上调，其他时段较正常水平均发生下调。

注：A、C和E分别为24、48和60 h的对照细胞；B.、D、F分别为PPV感染后24、48和60 h 细胞。

Note: A, C and E were untreated cell in the post 24, 48 and 60 h, respectively ; B, D and F were PK-15 cells infected with PPV at 24, 48 and 60 h post-infection, respectively.

图1PPV感染PK-15细胞后细胞形态(×100)
Fig.1CellmorphologyofPK-15cellsinfectedwithPPV(×100)

3 结论与讨论

随着分子生物学与病毒学研究的发展，人们对病原微生物的作用机制有了更深入的了解和认识。TLRs和其他分子识别受体能够识别病原微生物的多种PAMPs，这种识别机制使TLRs在先天性免疫和固有免疫中发挥重要作用，然而由于免疫机制的复杂性，人们至今仍然无法系统揭示天然免疫是如何识别微生物病原体的，人们也无法了解天然免疫系统是如何精细调控和诱导获得性免疫的。

近几年研究发现，TLRs在病毒感染中发挥重要作用。徐春利等[16]研究发现，HBV感染中能够激活TLRs，并调节天然免疫应答及获得性免疫应答。XU等[17]研究发现，慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B, CHB)患者外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)和浆样树突细胞(plasmacytoid dendritic cell, pDCs)上TLR7和TLR9 mRNA表达量和TLR7蛋白表达量低于正常人群，而TLR9蛋白表达量高于正常人群；TLR9蛋白表达与HBV病毒DNA呈负相关，TLR9蛋白表达与HBV呈正相关，结果也表明HBV抑制TLR7和TLR9 mRNA表达，推测可能机体对HBV表现出免疫耐受和免疫逃逸。

本研究中在PPV感染细胞后，TLR1、TLR3～ TLR 8和TLR10 mRNA水平在部分时段发生上调，其他时段均低于正常水平，而TLR2和TLR9在感染后发生有规律的显著上调。关于TLR9病毒识别的研究已报道许多，研究发现该过程与自身免疫性疾病性相关[18]，但TLR9在PPV病毒的研究中尚未报道。本研究采用PPV感染PK-15细胞，发现PPV处理组的细胞内TLR2和TLR9 mRNA的表达量在处理后前6 h低于正常组细胞，12 h后TLR2及TLR9的mRNA表达量显著高于正常组细胞；因此后续试验研究时间点的设计可以集中在6 h及以后。这一研究结果与张月华等[21]在人细小病毒的研究结果一致。根据本研究可以推测，在感染前期细胞表现免疫耐受，随着细胞的增殖，PPV病毒得到扩增，大量的PPV病毒诱导细胞TLR2和TLR9 mRNA的显著上调；PPV可能通过上调TLR2和TLR9的表达改变机体的免疫应答，导致PPV持续感染。王强等[19]采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测传染性单核细胞增多症(Infectious Mononucleosis， IM)，患者外周血单核细胞内TLR2和TLR9的表达量，结果发现IM患者体内TLR2和TLR9 mRNA表达量相对于正常人显著上调，而IM恢复期TLR2和TLR9的表达相对下调，推测TLR2与TLR9表达上调能够识别病原体，引发机体免疫应答反应。另有研究发现，TLR9缺陷小鼠的病毒滴度和死亡率较正常小鼠上升，表明TLR9在抗病毒免疫应答反应中发挥重要的作用[20]。因此我们推测，TLR2和TLR9可能能够识别PPV病毒，并通过一定配体活化TLR2和TLR9。试验结果显示，TLR2、TLR9可能在猪感染PPV 24 h后发挥抗病毒作用。

注：星号表示统计感染组和对照组差异显著，*P<0.05和**P<0.01。

Note: An asterisk indicates a statistically significant difference from infected and control cells, *P<0.05 and **P<0.01.

图2PPV感染PK-15后TLR1～TLR10mRNA水平表达情况
Fig.2ThemRNAexpressionofTLR1toTLR10inPK-15cellsafterPPVinfection

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(责任编辑：蒋国良)

Changesoftoll-likereceptorstranscriptionalprofilesofPK-15cellculturesfollowinginfectionwithporcineparvovirus

ZHOU Yong1,2, JIN Xiaohui1,2, LI Bingxiao1,2， JING Yaxing1, HAN Li1, ZHANG Liwei1,2, WEI Zhanyong1,2

(1.College of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;2.Key Laboratory for Animal-derived Food Safety of Henan Province, Zhengzhou 450002, China)

This study was conducted to detect the expression of TLRs after PPV infected PK-15 cell, which aimed to explove the theoretical basis of proven PPV infection mechanism.The transcription of TLR1-10 in PPV infected PK-15 cells was detected by real-time PCR method. The results showed that TLR1 in PK-15 cells after PPV infection up-regulated in 3 hours and was about 3.1 times of the control group cells, other times were lower than the normal level; TLR3 and TLR7 mRNA expression in the initial stage of infection were lower than the normal level; the content of mRNA TLR4 and TLR8 were 3, 12 and 36 h after infection increased; TLR10 expression in 3 h and 36 h increased respectively, other times were reduced to varying degrees; while TLR2 and TLR9 expression level of mRNA in 24 h after infection began to increase, and reached the peak at 48 h, and respectively 10.1 times and 26.7 times higher than those in blank. Studies show that PPV infected PK-15 cells can induce the TLR2 and TLR9 in the mRNA level was significantly increased.PPV infection may be mediated by TLR2 and TLR9 receptors.

porcine parvovirus; Toll-loke receptor; PK-15 cell; transcriptional profiles

S858.28

：A

2016-11-25

国家自然科学基金项目(U140410985)

周 雍(1990-)，女，河南周口人，硕士研究生，主要从事病原生物学和分子病毒学方面的研究。

魏战勇(1975-)，男，河南安阳人，教授，博士。

1000-2340(2017)02-0201-06