L-茶氨酸对α-淀粉酶和胰蛋白酶的抑制作用

袁冬寅

龙 军2

龚志华1

林 玲1

周 阳1

彭影琦1

肖文军1,3

(1. 湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2. 常德市柳叶湖旅游度假区七里桥街道办事处，湖南 常德 415000；3. 湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128)

L-茶氨酸对α-淀粉酶和胰蛋白酶的抑制作用

袁冬寅1

龙 军2

龚志华1

林 玲1

周 阳1

彭影琦1

肖文军1,3

(1. 湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2. 常德市柳叶湖旅游度假区七里桥街道办事处，湖南 常德 415000；3. 湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128)

以L-茶氨酸为原料，通过建立最佳酶促反应体系，采用非连续测定和作图法研究了L-茶氨酸对α-淀粉酶、胰蛋白酶的抑制作用及其动力学特征，为L-茶氨酸的深层开发利用提供参考。结果表明，L-茶氨酸对α-淀粉酶和胰蛋白酶的抑制效果均与其质量浓度呈正比，在底物质量浓度1%、体系添加顺序为酶与抑制剂在37 ℃预热5 min后加入底物的条件下，L-茶氨酸抑制α-淀粉酶的最优条件为α-淀粉酶质量浓度0.018 mg/mL、反应时间3 min，IC50为26.078 mg/mL，当酶量为18 518.52 U时，α-淀粉酶的Km为2.247 mg/mL；在底物质量浓度1%、体系添加顺序为胰蛋白酶与抑制剂在40 ℃预热5 min后加入底物的条件下，L-茶氨酸抑制胰蛋白酶的最优条件为胰蛋白酶质量浓度0.252 mg/mL、反应时间15 min，IC50为196.299 mg/mL，当酶量为1 055 931 U时，胰蛋白酶的Km为5.189 mg/mL。说明L-茶氨酸对α-淀粉酶和胰蛋白酶均有一定的抑制作用，且抑制α-淀粉酶的效果较好。

L-茶氨酸；α-淀粉酶；胰蛋白酶；抑制作用；糖脂代谢

L-茶氨酸(N-乙基-γ-L-谷氨酰胺)是茶叶中特有的一种非蛋白质氨基酸，属酰胺类化合物[1]，具有降血压[2]、提高记忆力[3-4]、安神镇静[5]、保护脑神经细胞[6]、调节免疫[7]、辅助抗肿瘤[8]、减肥降脂[9]等多种生物活性，广泛应用于医疗、保健、食品等领域[10]。α-淀粉酶、胰蛋白酶是与机体糖脂代谢密切相关的两种酶[11-12]，其中，α-淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，是一种淀粉内切酶，其作用方式是在淀粉分子内部随机切开α-1,4糖苷键，并生成糊精和还原糖[13-14]；胰蛋白酶是动物胰脏的主要蛋白质水解酶[15]，能将蛋白质分解成氨基酸，供人体吸收利用[16]。然而，目前尚未见L-茶氨酸抑制α-淀粉酶、胰蛋白酶生物活性研究的相关报道。为探索L-茶氨酸体外调节糖脂代谢的生物活性，本研究以L-茶氨酸为原料，通过建立最佳酶促反应体系，采用非连续测定和作图法研究L-茶氨酸对α-淀粉酶、胰蛋白酶的抑制作用及其动力学特征，以期为L-茶氨酸的深层开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-茶氨酸：纯度≥98%，德国Sigma试剂公司；

α-淀粉酶(Lot.RM3018Y359)：4 U/mg，上海瑞永生物科技有限公司；

胰蛋白酶(批号20160216)：50 U/mg，国药集团化学试剂有限公司；

可溶性淀粉、干酪素、碳酸钠、四水酒石酸钾钠、三氯乙酸、福林酚：国产分析纯。

1.2 仪器与设备

精密电子天平：Mettler AE240型，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；

pH计：PHS22C型，上海雷磁仪器厂；

数显恒温水浴锅：HH型，上海精宏实验设备有限公司；

紫外分光光度计：UV-2550型，日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖标准曲线制作 配制2 mg/mL的葡萄糖标准液，分别吸取0.00，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL置于10 mL容量瓶中，在37 ℃水浴锅中预热5 min后，各加入0.5 mL DNS溶液混合，沸水浴5 min，冷却，加水定容至10 mL，用分光光度计于540 nm测吸光值。以不加葡萄糖溶液为空白对照组。求得葡萄糖的标准曲线为y=12.046x+0.022 7 (R2=0.999) 。

1.3.2α-淀粉酶最适酶促反应条件筛选

(1) 酶质量浓度确定：配制质量浓度分别为0.006，0.010，0.014，0.018，0.022，0.026，0.030 mg/mL的α-淀粉酶溶液,分别置于7支试管中，在37 ℃条件下与底物溶液混匀进行反应，于540 nm处测吸光值，选择最佳酶质量浓度。

(2) 反应时间及酶量确定：采用最佳酶质量浓度，按表1顺序添加试剂，测定反应初始速率。由于建立动力学方程最重要的是确定酶量与反应时间，以确保酶初始速率达到最大，即当底物浓度足够大时，反应速率趋于极限值，几乎不再随底物浓度的增加而改变，符合零级反应特征；酶量过高或过低都不适宜建立酶反应动力学方程。因此，选择的酶量须保证每分钟反应体系在540 nm处的吸光值变化为0.03～0.25[17]。酶反应开始时，立即计时，每隔1 min，加入DNS溶液终止反应，于540 nm处测吸光值，筛选最佳反应时间和最佳酶量。

表1 酶量确定

(3) 酶促反应动力学方程的建立：采用最佳反应时间和最佳酶量，保持酶质量浓度不变，分别在0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%，1.6%的底物浓度下，于540 nm处测吸光值，并计算出酶促反应的初始速率，按双倒数法作图(Vmax=1/纵截距，Km=斜率×Vmax)与米氏方程(1/V=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax)，求出Km和Vmax。

(4) 底物、酶、抑制剂添加顺序确定：采用最佳反应时间，将可溶性淀粉、α-淀粉酶、L-茶氨酸按如下3种顺序添加：① 3种物质先各自在37 ℃水浴锅中预热5 min，再同时加入试管中反应；② 先将可溶性淀粉与L-茶氨酸置于试管中，在37 ℃水浴锅中预热5 min，再加入α-淀粉酶反应；③ 先将α-淀粉酶与L-茶氨酸置于试管中，在37 ℃水浴锅中预热5 min，再加入可溶性淀粉反应。比较3种方式的抑制率，选择最佳添加顺序。

1.3.3 最优酶促反应条件下L-茶氨酸对α-淀粉酶的抑制效果 采用最佳添加顺序，在9支试管中分别加入α-淀粉酶与质量浓度为2，10，15，20，25，30，35，40，45 mg/mL的L-氨基酸，摇匀，在37 ℃水浴锅中预热5 min，加底物反应3 min后，立即加入DNS溶液，沸水浴5 min，冷却，稀释。背景对照为底物溶液与抑制剂，空白对照为煮沸的酶液，在540 nm处测吸光值。抑制活性按式(1)计算，其中A值均为540 nm处的吸光值。

1.3.4 酪氨酸标准曲线制作 配制质量浓度为1 mg/mL的酪氨酸，用时再稀释10倍得0.1 mg/mL的酪氨酸标准溶液。按表2顺序添加试剂，混合，放入40 ℃水浴保温20 min后，冷却至室温，于660 nm比色。1号试管为空白对照组。求得酪氨酸的标准曲线为y=0.063 8x+0.020 7 (R2=0.998 1)。

表2 酪氨酸标准曲线试剂加入顺序

1.3.5 胰蛋白酶最适酶促反应条件筛选

(1) 酶质量浓度确定：配制质量浓度分别为0.042，0.084，0.126，0.168，0.210，0.252，0.294 mg/mL的胰蛋白酶溶液置于7支试管中，在40 ℃条件下与底物混匀进行反应，于660 nm处测定吸光值，选择合适的酶质量浓度。

(2) 反应时间确定：在40 ℃的水浴条件下，于6支试管中分别加入最佳质量浓度的胰蛋白酶溶液与底物反应，于660 nm处测不同反应时间(5，10，15，20，25，30 min)下的吸光值，并计算出酪氨酸的生成量，选择最适酶促反应时间。

(3) 酶促反应动力学方程的建立：经预试验，确定进行酶促反应动力学常数测定的酶量为1 055 931 U，反应时间为3 min，保持酶质量浓度不变，在不同的底物浓度(0.4%，0.6%，0.8%，1%，1.2%，1.4%)下，于660 nm处测吸光值，并计算出酶促反应的初始速率，按双倒数法作图(Vmax=1/纵截距，Km=斜率×Vmax)与米氏方程(1/V=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax)，求出Km和Vmax。

(4) 底物、酶、抑制剂添加顺序确定：采用最佳反应时间，将干酪素、胰蛋白酶、L-茶氨酸按如下3种顺序添加：① 3种物质先各自在40 ℃的水浴中预热5 min，再同时加入试管中反应；② 先将干酪素与L-茶氨酸置于试管中，在40 ℃的水浴中预热5 min，再加入胰蛋白酶反应；③ 先将胰蛋白酶与L-茶氨酸置于试管中，在40 ℃的水浴中预热5 min，再加入干酪素反应。比较3种方式的抑制率，选择最佳添加顺序。

1.3.6 最优酶促反应条件下L-茶氨酸对胰蛋白酶的抑制效果 采用最佳添加顺序，在5支试管中分别加入胰蛋白酶与质量浓度分别为2，50，100，150，200 mg/mL的L-氨基酸，混匀，在40 ℃水浴中预热5 min，再加入底物反应15 min后，立即加入TCA溶液终止反应，3 500 r/min离心10 min，取上清液，加碳酸钠和福林酚，40 ℃水浴保温20 min，冷却，于660 nm处测定吸光值。背景对照为底物溶液与抑制剂，空白组为失活的酶液。抑制率按式(1)计算，其中A值均为660 nm处的吸光值。

1.3.7 色度测定

(1) 不同浓度的葡萄糖色度：采用紫外分光光度计测定，用吸光值A540来表示。

(2) 不同浓度的酪氨酸色度：采用紫外分光光度计测定，用吸光值A660来表示。

1.3.8 检测及统计方法

(1) 抑制率：按式(1)计算抑制率。

(1)

式中：

I——抑制率，%；

A1、A2、A3、A4——分别为无抑制组、空白组、加抑制组和背景对照组的吸光值。

(2)α-淀粉酶活力测定：采用Berndeld法[18]。

(3) 胰蛋白酶活力测定：采用Lowry蛋白质测定法[19]。

(4) 统计方法：数据利用Excel 2013处理，IC50利用SPSS软件中的Profit分析方法计算得出。

2 结果与分析

2.1α-淀粉酶最适酶促反应条件筛选

2.1.1 酶质量浓度确定 由图1可知，在一定范围内，随着酶质量浓度的增加，吸光值增大。α-淀粉酶质量浓度在0.01～0.018 mg/mL时，有较好的线性关系，吸光值与酶质量浓度呈正比。α-淀粉酶质量浓度在0.01～0.022 mg/mL时，反应速率随酶质量浓度的增加而逐渐减慢，最终将达到平衡。为使酶促反应速率保持最大，α-淀粉酶质量浓度宜选择0.018 mg/mL。

图1 α-淀粉酶质量浓度对酶活性的影响

2.1.2 反应时间与酶量确定 由图2可知，反应时间在3 min内，线性反应速度随着酶量的增加而增大。比较不同酶量的反应时间，发现所有的酶反应进程曲线在3 min内，均有较好的线性关系，因此选择3 min内测得的速度为反应初始速率。参照刘睿等[17]的研究方法，比较反应初速率，确定以酶量18 518.52 U、反应时间3 min进行酶反应动力学研究。

图2 α-淀粉酶不同酶量的反应进程曲线

2.1.3 酶促反应动力学方程的建立 由图3可知，拟合曲线方程为y=12.304x+5.474 8，R2=0.993 4，求得Vmax=0.183 mg/(mL·min)，Km=2.247 mg/mL。

2.1.4 底物、酶、L-茶氨酸添加顺序确定 由图4可知，添加顺序为①、②、③的抑制率分别为18.6%，16.8%，20.6%，但3种添加顺序的差异不显著(P>0.05)，其中顺序③的抑制率相对最高，比顺序②的抑制率高出3.8%，因此选顺序③作为酶促反应体系的添加顺序，与刘雯等[20]建立的抑制剂添加顺序一致。

2.2 最优酶促反应条件下L-茶氨酸对α-淀粉酶的抑制效果

由图5可知，L-茶氨酸对α-淀粉酶的抑制效果随L-茶氨酸质量浓度的增大而增加；当L-茶氨酸质量浓度高于25 mg/mL时，抑制率的增长速度加快。当L-茶氨酸质量浓度到达45 mg/mL时，抑制率为97.9%。经计算，L-茶氨酸对α-淀粉酶的IC50为26.078 mg/mL。

图3 α-淀粉酶的米氏方程曲线

图4 不同添加顺序对α-淀粉酶抑制作用的影响

图5 不同质量浓度L-茶氨酸对α-淀粉酶的抑制效果

2.3 胰蛋白酶最适酶促反应条件筛选

2.3.1 酶质量浓度确定 由图6可知，吸光值随胰蛋白酶质量浓度的增加而增大且最终趋于平稳，当酶质量浓度达到0.252 mg/mL时，吸光值已达最大值，说明胰蛋白酶与底物基本反应完全。因此选择酶质量浓度0.252 mg/mL较为合适。

2.3.2 酶促反应时间确定 由图7可知，酶促反应时间在0～15 min时，产物的含量随时间的延长而增多。在反应15 min后，吸光值趋于稳定，产物含量的增长速率变慢，说明胰蛋白酶与底物基本完全反应。因此，反应时间选择15 min较为合适。

图6 胰蛋白酶质量浓度对酶活性的影响

图7 最佳反应时间的筛选

2.3.3 酶反应动力学方程的建立 由图8可知，拟合曲线方程为y=49.783x+9.593 1，R2=0.994 0，求得Vmax=0.104 mg/(mL·min)，Km=5.189 mg/mL。

图8 胰蛋白酶的米氏方程曲线

2.3.4 底物、酶、L-茶氨酸添加顺序确定 由图9可知，添加顺序为①、②、③的抑制率分别为14.24%，13.57%，13.90%，抑制率结果与秦昱等[12]抑制剂添加顺序结果一致，且3种添加顺序的差异不显著(P>0.05)，为了避免底物的干扰并降低试验操作的难度，故选择顺序③作为酶促反应体系的添加顺序。

2.4 最优酶促反应条件下L-茶氨酸对胰蛋白酶的抑制效果

由图10可知，在试验设定的质量浓度范围内，L-茶氨酸对胰蛋白酶活性的抑制呈量效关系，抑制效果随质量浓度的增大而增加。经计算，L-茶氨酸对胰蛋白酶的IC50为196.299 mg/mL。

图9 反应体系添加顺序对胰蛋白酶抑制效果的影响

图10 不同质量浓度L-茶氨酸对胰蛋白酶抑制作用

Figure 10 Inhibitory effect ofL-theanine at various concentrations on the activity of trypsin

3 结论

研究表明，L-茶氨酸对α-淀粉酶、胰蛋白酶均有一定的抑制作用，其半抑制浓度分别为26.078，196.299 mg/mL。α-淀粉酶在酶量为18 518.52 U、反应时间为3 min时得Km为2.247 mg/mL。胰蛋白酶在酶量为1 055 931 U，反应时间为3 min时得Km为5.189 mg/mL。本试验对L-茶氨酸体外抑制这两种酶的作用进行了初步研究，为进一步探讨L-茶氨酸对α-淀粉酶、胰蛋白酶的抑制类型及其调节糖脂代谢的作用机制提供依据，为其功能产品的开发利用提供了参考。

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Inhibitory effects of L-theanine on α-amylase and trypsin

YUANDong-yin1

LONGJun2

GONGZhi-hua1

LINLing1

ZHOUYang1

PENGYing-qi1

XIAOWen-jun1,3

(1.KeyLaboratoryofTeaScienceofEducationalMinistration,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China; 2.QiliBridgeSubdistrictOffice,WillowLakeResort,ChangdeCity,Changde,Hunan415000,China; 3.HunanCollaborativeInnovationCenterforUtilizationofFunctionalIngredientsfromBotanicals,Changsha,Hunan410128,China)

The inhibitory effects ofL-theanine on the activities ofα-amylase and trypsin were studied by establishing the best reaction system and adopting research method on graph in order to provide reference for the deep development ofL-theanine. The results showed that the inhibitory effects ofL-theanine on both enzyme activities were positively associated with its concentration.IC50(26.078 mg/mL) ofL-theanine on the activities ofα-amylase was achieved by prewarming enzyme at a concentration of 0.018 mg/mL in the presence ofL-theanine at 37 ℃ for 5 min before addition of 1% starch and allowing reaction to proceed for 3 min.Kmofα-amylase was 2.247 mg/mL on the premise that the enzyme amount was 18 518.52 U.L-theanine exhibited the half inhibition on trypsin (196.299 mg/mL) by prewarming their mixture at 40 ℃ for 5 min followed by addition of 1% casein as the substrate and permitting the reaction for 15 min. When the amount of enzyme was 1 055 931 U,Kmof trypsin was 5.189 mg/mL. Statistics results showed that the inhibitory effect ofL-theanine on the activity ofα-amylase was superior than that of trypsin.

L-theanine;α-amylase; trypsin; inhibitory effect; glucose and lipid metabolism

湖南省科技厅重点研发计划(编号：2016NK2102)

袁冬寅，女，湖南农业大学在读硕士研究生。

肖文军(1969—)，男，湖南农业大学教授，博导。 E-mail：xiaowenjun88@sina.com

2017—05—04

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.001