晚期糖基化终产物受体在多囊卵巢综合征大鼠模型中的表达

赵彦楠，刘洪祥，马晓欣

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

·论著·

晚期糖基化终产物受体在多囊卵巢综合征大鼠模型中的表达

赵彦楠，刘洪祥，马晓欣

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

目的研究晚期糖基化终末产物受体（RAGE）及血清中可溶性晚期糖基化终末产物受体（sRAGE）在脱氢表雄酮诱导的大鼠模型中的表达，并进一步探讨sRAGE对卵巢功能的影响。方法采用脱氢表雄酮联合高脂饮食造模法建立多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠模型。造模成功后，选用竞争性 ELISA 法检测血清中 sRAGE 及抗苗勒管激素（AMH）表达水平，免疫组织化学法检测大鼠模型卵巢组织中 RAGE 的表达。结果RAGE 在模型组卵巢组织中显著高表达（P ＜ 0.01）。模型组血清 sRAGE 水平明显低于对照组（P ＜ 0.05），血清 AMH 含量高于对照组（P＜ 0.05），且 sRAGE 与 AMH 表达呈负相关。结论RAGE 及 sRAGE 对PCOS的诊断和发病机制以及对卵巢功能的影响均有重要的参考价值。

多囊卵巢综合征；晚期糖基化终产物受体；大鼠模型

晚 期 糖 基 化 终 末 产 物 受 体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）是免疫球蛋白超家族成员，属于多配体受体，在膜表面与其配体结合后可引起细胞内炎症反应和氧化应激，进而引发细胞损伤［1］。可溶性晚期糖基化终产物受体（soluble form of receptor for advanced glycation end prod-ucts，sRAGE）是 RAGE 的一种异形体，由多种细胞合成、分泌，在循环系统中含量很高［2］。由于 sRAGE缺乏受体膜镶嵌区域与胞内结构域，无法完成细胞信号转导，可以特异性结合其配体晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs），从 而 阻断促炎、促凝反应以及肿瘤发生等多种病理生理过程［3］。多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育龄期妇女常见的一种生殖内分泌代谢障碍疾病［4］。研究［5］发现 PCOS 患者体内 C 反应蛋白、肿瘤坏死因子α等多种炎性细胞因子水平均高于正常人。近年来一系列炎性失调疾病的研究发现，sRAGE在冠状动脉粥样硬化性心脏病、类风湿关节炎和慢性阻塞性肺疾病等疾病的发生和发展中起到重要作用，被认为是一种可靠的炎症标志物［6］。但sRAGE、RAGE对PCOS的影响还知之甚少。本课题组前期研究发现，脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）联合高脂饮食法制作的 PCOS 大鼠模型出现的卵巢病理改变及激素水平改变等典型内分泌变化与PCOS患者相似，是一种较为理想的PCOS动物模型。本研究通过建立PCOS大鼠模型，研究RAGE、sRAGE 在PCOS大鼠模型中的表达，探讨其对PCOS的临床意义并进一步探讨其对卵巢功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

选取 40 只 21 日龄雌性 SD 大鼠，体质量 200～250 g，均购自中国医科大学本溪实验动物中心。大鼠 sRAGE-ELISA 试剂盒、大鼠 AMH-ELISA 试剂盒均购自美国 Cloud-Clone 公司；兔多克隆抗体 RAGE购自美国Abcam公司；免疫组化SP试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立 PCOS 模型：采用随机数字表法将 40 只大鼠随机分为实验组（n=20）和对照组（n=20）。每只大鼠均自由进食，自由饮水，室温（22.0±3.0）℃，照明采用昼夜亮暗周期循环。将 DHEA（60 mg/kg）溶于 0.2 mL 注射油剂中，模型组大鼠每日颈背部皮下注射 DEHA+注射油 剂 0.2 mL，同时喂以高 脂 饲料，连续 8 周；对照组大鼠每日颈背部皮下注射 0.2 mL注射油剂，连续8周。

1.2.2 标本采集：造模成功后腹腔注射 10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血约5 mL，分离血清，-80 °C冻存备用。分离摘取双侧卵巢，修剪多余组织及脂肪组织后，双侧卵巢置于10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，切片待测。

1.2.3 血清中 sRAGE 和 AMH 测定：ELISA 法检测血清中sRAGE和 AMH水平。操作步骤按说明书进行，450 nm 波长酶标仪进行检测。

1.2.4 免疫组织化学染色：检测方法采用免疫组化SP法，进行RAGE免疫组化染色，一抗浓度稀释为1∶20，以PBS 代替一抗作为阴性对照。阳性结果判断：光学显微镜下观察为棕黄色颗粒即RAGE表达阳性。高倍镜下每例随机选取5个不重叠的视野，估计阳性细胞百分数后取均值。按阳性细胞百分数评分：＜5%为0分，5%～＜25%为1分，25%～＜50%为2分，50%～＜75%为3分，≥75%为4分；按染色强度评分：无着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。2项相乘后取平均值，0～4分为阴性表达，＞4分为阳性表达。

1.3 统计学分析

采用 SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析。计量资料以x± s描述，组间比较采用t检验。2组间RAGE阳性表达率的比较采用χ2检验。相关性分析采用 Pearson 检验。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组大鼠卵巢形态学比较

光学显微镜下卵巢HE染色可见对照组卵巢形态正常，卵泡发育正常，皮质可见不同发育阶段的卵泡及黄体。模型组镜下可见较多闭锁卵泡及囊性扩张性卵泡且多集中在卵巢边缘，卵泡内颗粒细胞层数明显减少甚至消失，卵巢呈典型的多囊样变，符合多囊卵巢病理改变。见图1。

2.2 2组大鼠血清中 sRAGE和AMH水平比较

2.2.1 血清 sRAGE 水平比较：模型组和对照组血清中 sRAGE 含 量 分 别 为（0.19 ± 0.02）和（1.96 ± 0.17）ng/mL，模型组血清中 sRAGE 水平明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。

图1 2组大鼠卵巢组织HE染色切片 ×4Fig.1 HE staining of ovarian tissue from the control and PCOS groups ×4

2.2.2 血清 AMH 水平比较：模型组和对照组血清中AMH 含量分别为（5 293.8±333.2）和（3 591.9±224.9）pg/mL，模型组血清中AMH水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。

2.2.3 模型组血清 sRAGE 与 AMH 浓度相关性：直线相关性分析显示，模型组的血清sARGE与AMH浓度呈负相关（r=-0.734，P＜ 0.05）。

2.3 RAGE在PCOS大鼠模型卵巢中的表达

免疫组化结果显示，RAGE主要位于卵巢颗粒细胞的胞质内及细胞核上。对照组卵巢颗粒细胞及卵泡膜细胞染色强度减弱，甚至未见染色（图2A）。模型组中RAGE在卵巢颗粒细胞和卵泡膜细胞胞质以及部分内皮细胞呈棕褐色颗粒，呈明显的阳性表达（图2B）。对照组和模型组RAGE的阳性表达率分别为 15%（3/20）和 90%（18/20），半定量分析RAGE表达的结果显示，与对照组相比，RAGE在模型组卵巢组织中呈显著高表达，差异有统计学意义（χ2=22.56，P＜ 0.01）。

图2 免疫组化法观察RAGE在PCOS大鼠模型卵巢中的表达 ×100Fig.2 Immunohistochemical analysis of RAGE expression in the PCOS rat model ×100

3 讨论

PCOS是一种以胰岛素抵抗及高雄激素血症为核心病理机制，与生殖、内分泌密切相关的全身性代谢障碍性疾病［7］。越来越多证据显示，PCOS 患者机体长期处于慢性低度炎症状态，这可能是导致患者生殖与代谢障碍的重要原因［8］。其体内白细胞介素6、白细胞介素18等炎性细胞因子水平往往升高，且与雄激素水平及胰岛素抵抗呈正相关［9］。RAGE是一种跨膜蛋白，在体内多种组织中均有表达，如心、肺、骨骼肌、卵巢等［10］。但当组织中出现氧化应激或RAGE配体聚集时，RAGE表达明显上调，形成正反馈作用，使细胞处于持续激活状态，导致快速的细胞活化 及 促炎症转录因子水 平 持 续升高［11］。本研究采用免疫组化方法检测RAGE在模型组与对照组卵巢组织中的蛋白表达，证实RAGE在模型组卵巢颗粒细胞中呈高表达，与本课题组前期研究发现AGEs在PCOS大鼠模型卵巢组织中表达升高的结果一致，提示RAGE与PCOS发生密切相关。并且可能是通过与其配体AGEs结合，促进炎性细胞因子的产生、诱导氧化应激的形成，进而造成颗粒细胞损伤及功能紊乱［12］。

相对于RAGE，sRAGE被认为是一种“好”受体，由 RAGE 选择性剪切产生［13］。其主要存在于循环系统中，可阻止AGEs或其他配体与RAGE结合，从而对机体产生保护作用［14］。糖尿病大鼠模型研究显示，sRAGE 经腹腔注射后可干扰 AGEs-RAGE 相互作用，减少蛋白尿及抑制动脉粥样硬化的早期形成［15］。由此可见，sRAGE 可能是 PCOS 的保护因素，能够竞争性结合模型组大鼠体内堆积的AGEs，故使血清中游离的sRAGE水平降低，因此模型组血清中sRAGE的水平明显低于对照组。

AMH由颗粒细胞分泌，由于其在人体水平不受月经影响，又十分灵敏，在评价卵巢功能方面是一个良好的指标［16］。它通过降低卵泡对卵泡刺激素的敏感性以及抑制颗粒细胞芳香酶的活性起到抑制卵泡发育的作用，在卵泡的募集中起到重要的作用［17］。DEWAILLY 等［18］发现，AMH 水平升高能够提示PCOS患者排卵障碍。本研究发现，模型组血清AMH浓度明显高于对照组，提示PCOS大鼠模型可能存在排卵障碍。进一步分析还发现，血清sRAGE浓度与AMH呈负相关。由此可见，sRAGE可能间接反映卵巢功能，其机制可能是其结合血液中及卵泡液中累积的AGEs，进而减少对血管内皮细胞的损伤及促炎性细胞因子的释放［19］。

PCOS作为一种发病机制复杂、由环境与致病基因共同作用导致的疾病，目前尚无根治方法。并且，其远期并发症如2型糖尿病、动脉粥样硬化、子宫内膜癌等更是给女性身心键康带来伤害［20］。若能够早期做出诊断，进行针对性治疗，可有效改善患者预后。本研究证明RAGE在PCOS大鼠模型组卵巢组织中表达明显升高，提示RAGE可能通过某种途径参与PCOS的发病过程，为PCOS的治疗提供新的靶点。模型组血清中sRAGE显著降低，可能是PCOS的保护因素，也为PCOS的辅助诊断提供一定依据。同时，sRAGE 浓度与 AMH 呈负相关，提示sRAGE 不仅能够作为PCOS诊断的标志物，也可能是卵巢功能的潜在评估指标。但RAGE、sRAGE 影响卵泡发育以及卵巢功能的机制尚不完全清楚，有待更多深入研究来揭示。

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（编辑 陈 姜）

Expression of Receptor for Advanced Glycation End Products in a Rat Model of Polycystic Ovarian Syndrome

ZHAO Yannan，LIU Hongxiang，MA Xiaoxin

（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the expression of receptor for advanced glycation end products（RAGE）and soluble RAGE（sRAGE）in a rat model of dehydroepiandrosterone-induced polycystic ovary syndrome（PCOS）and to explore the role of sRAGE in ovarian function.MethodsThe PCOS rat model was established using dehydroepiandrosterone in combination with a high-fat diet.In animals with confirmed PCOS induction，serum concentrations of sRAGE and AMH were measured by competitive ELISA，and RAGE expression in ovarian tissues was detected by immunohistochemistry.ResultsRAGE expression was significantly higher in the PCOS group than in the control group（P ＜ 0.01）.Serum concentrations of sRAGE and AMH were significantly lower and higher than those in the control group（P ＜ 0.05），respectively.Furthermore，sRAGE level was negatively correlated to that of AMH.ConclusionRAGE and sRAGE levels influence ovarian function and have substantial reference value in the diagnosis and pathogenesis of PCOS.

polycystic ovarian syndrome；receptor for advanced glycation end products；rat model

R711.75

A

0258-4646（2017）09-0769-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170906.1317.002.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.09.001

国家自然科学基金（81472438，81272874）；辽宁省科学技术计划（2013225079）；沈阳市科学技术计划（F14-158-9-47）；盛京自由研究者基金

赵彦楠（1993-），女，硕士研究生.

马晓欣，E-mail：maxiaoxin666@aliyun.com

2017-03-16

网络出版时间：2017-09-06 13:17