利拉鲁肽对高糖诱导的炎症单核细胞亚群分化的影响

申亚丽，蒋昆，张敏丽，苏艳红，张大庆

（中国医科大学附属盛京医院心内科，沈阳 110004）

利拉鲁肽对高糖诱导的炎症单核细胞亚群分化的影响

申亚丽，蒋昆，张敏丽，苏艳红，张大庆

（中国医科大学附属盛京医院心内科，沈阳 110004）

目的探讨利拉鲁肽对高糖诱导的单核细胞亚群分化的影响及其机制。方法制备小鼠脾脏原代细胞悬液，高糖刺激诱导单核细胞亚群分化，进一步采用利拉鲁肽进行干预，利用流式细胞仪检测单核细胞亚群分化情况，依据Ly6C的表达量将单核细胞分为 Ly6Clow，Ly6Cmid，Ly6Chi3 个亚群。再以 2’，7’-二氯荧光黄-二醋酸盐（DCFH-DA）标记细胞，通过流式细胞仪检测细胞内二氯荧光黄（DCF）的荧光强度，评估各单核细胞亚群的活性氧簇（ROS）水平。结果15，25，35 mmol/L 葡萄糖可浓度依赖性地促进 Ly6Chi和 Ly6Cmid单核细胞亚群分化，且能增加 Ly6C+单核细胞内 ROS 的产生，而对 Ly6C-单核细胞中 ROS 的水平没有影响。100 U、200 U 利拉鲁肽浓度依赖性地抑制高糖诱导的 Ly6Cmid和 Ly6Chi单核细胞亚群分化，并使 Ly6Clow单核细胞亚群明显增加。利拉鲁肽显著抑制高糖诱导的 Ly6C+单核细胞中 ROS平，但对 Ly6C-单核细胞中的 ROS无影响。结论利拉鲁肽可抑制高糖诱导的炎症单核细胞亚群分化，并减少ROS的产生。

利拉鲁肽；糖尿病；氧化应激；炎症单核细胞

研究［1］表明，2 型糖尿病患者心血管并发症的风险是非糖尿病患者的2～4倍，约有70%的2型糖尿病患者死于心血管并发症。糖尿病患者动脉粥样硬化性心血管疾病发生早，病变弥漫且重，预后差［2］。探讨糖尿病动脉粥样硬化病变的发病机制及干预因素具有重要价值。

最近，研究［3-4］证实人和小鼠的单核细胞均具有异质性，不同单核细胞亚群对动脉粥样硬化病变的贡献不同。根据其表面Ly6C的表达情况，将单核细胞 分 为 3 个 亚 群：Ly6Chi，Ly6Cmid和 Ly6Clow。 前 期 研究［3-4］证实，Ly6Chi，Ly6Cmid为炎症单核细胞，具有分泌炎性细胞因子、分化形成动脉壁内巨噬细胞、加重动脉粥硬化病变的作用，Ly6Clow为抗炎症单核细胞，能抑制动脉粥样硬化的进展。最新研究［5］证实，高糖能促进体外培养的小鼠炎症单核细胞的分化，参与动脉粥样硬化病变形成，可能与氧化应激反应有关，但具体干预机制尚不明确。目前研究［6］证实，新型降糖药物胰高血糖素样肽 1（glucagon-like-peptide-1，GLP-1）类似物（利拉鲁肽）除了有控制血糖的作用外，还具有抗氧化和抗炎作用。单核细胞和巨噬细胞均有大量的 GLP-1 受体蛋白表达［7］。GLP-1在动脉粥样硬化病变中的巨噬细胞亦有表达［8］。GLP-1类似物能减少单核细胞与血管内皮细胞黏附，且有研究［9］显示利拉鲁肽可能通过抑制氧化应激反应来抑制单核细胞黏附聚集以及血管内巨噬细胞分化，从而减轻糖尿病动脉粥样硬化病变。因此，推测利拉鲁肽有可能通过抗氧化作用干预高糖所诱导的炎症单核细胞亚群的分化。本研究将利用小鼠脾脏原代细胞体外培养，进一步探讨利拉鲁肽对高糖诱导的单核细胞亚群分化的调节及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 小鼠原代脾细胞悬液的制备与培养

选取6～8周龄 C57野生型雄性小鼠，腹腔深度麻醉后在无菌状态下取脾脏，于冰上用载玻片末端轻 轻 磨 匀 后 ，用 完 全 培 养 基（DMEM 450 mL，10% FBS 50 mL，2 mmol/L 谷 氨 酰 胺 5 mL，10 mmol/L HEPES 5 mL，0.1mmol/L 非 必 需 氨 基 酸 5 mL，1 mmol/L 丙酮酸 钠 5 mL，50 μmol/L β -巯 基乙醇 250 μL。）冲洗2 次，细胞悬液收集后低温离心 300g10 min，弃上清，以 3 mL 红细胞裂解液（碧云天公司）重悬，冰 上孵育 7 min，加入 9 mL 完全培养基终止裂解，离心弃去上清，过滤后重悬于 1 mL 完全培养基，计数后以每孔 1×106/mL 接种于 24 孔板，37 ℃，4% CO2恒温箱中培养。

1.2 高糖对单核细胞亚群分化的影响

将脾脏细胞悬液以每孔 1×106/mL 接种于 24 孔板，0 h 加入 100 U/mL IFN-γ（美国 Pepeotech 公司）作为基础刺激，24 h 加入终浓度为 0、15、25、35 mmol/L葡萄糖（美国 Sigma公司）或等浓度的甘露醇（美国Sigma公司）作为渗透压对照，继续 37 ℃，4%CO2恒温箱中培养48 h后收集细胞。

1.3 利拉鲁肽干预单核细胞亚群的分化

将脾脏细胞悬液以每孔 1×106/mL 接种于 24 孔板，0 h 加入 100 U/mL IFN-γ 作为基础刺激，23 h 加入 100 nmol/L、200 nmol/L 利拉鲁肽（丹麦诺和诺德公司），24 h 加入终浓度为 25 mmol/L 葡萄糖或甘露醇，继续 37 ℃，4%CO2恒温箱中培养 48 h 后收集细胞。

1.4 流式细胞仪检测

细胞收集后PBS洗涤，重悬于100 μL 染色缓冲液（美 国 BD PharmingenTM公 司），加 入 0.5 μg 的 抗CD11b-PE（美 国 BD PharmingenTM公 司）和 Ly6CFITC（美国 BD PharmingenTM公司）抗体，4 ℃孵育 30 min，洗涤 2 遍后重悬于 200 μLPBS（美国 Hyclone 公司），流式细胞仪（FACS Calibur，BD）检测单核细胞亚群分化情况。以SSC为纵轴，FSC为横轴设门，门1为总细胞，门2为单个核细胞，门2的单个核细胞中 CD11b+为单核细胞。以 CD11b-PE 为纵轴，以Ly6C-FITC 为横轴，根据 Ly6C-FITC 表达量将其分为 Ly6Clow，Ly6Cmid，Ly6Chi3 个单核细胞亚群。

1.5 活性氧（reactive oxygen species，ROS）测定

用无血清培养液（BI）按照 1∶1 000 的比例稀释DCFH-DA 探针（碧云天公司），终浓度为 10 μmol/L。收集细胞后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，使细胞浓度为 1×106/mL，37 ℃细胞培养箱内孵育 20 min。每5 min 颠倒一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。之后以抗-CD11b-PE、抗-Ly6C-APC（美国 BD PharmingenTM公司）抗体染色 30 min，流式检测单核细胞亚群内ROS含量。上机时以SSC为纵轴，FSC为横轴设门，门1为总细胞，门2为单个核细胞，门2的单个核细胞中CD11b+为单核细胞。以CD11b -PE 为纵轴，以 Ly6C-APC 为横轴，将单核细胞分为Ly6C+、Ly6C-亚群。再以横轴为 DCFH-DA，纵轴为细胞数，分别检测 Ly6C+、Ly6C-单核细胞中 ROS 水平。

1.6 统计学分析

所有体外细胞实验均独立重复3次，结果以x± s表示，采用 SPSS 20.0 进行统计学分析，2 组间比较采用独立样本t检验，P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 高糖促进脾脏原代细胞中炎症单核细胞的分化

与 对 照 组 相 比 ，15 mmol/L、25 mmol/L 和 35 mmol/L 葡萄糖作用下分别使 Ly6Chi单核细胞亚群增加了 126% 、146% 和 168%（P 分 别 为 0.041、0.026、0.019），而 Ly6Cmid单核细胞亚群增加了 124%、145%和 152%（P 分别为 0.043、0.026、0.020）。作为等渗对照，不同浓度的甘露醇对 Ly6Chi以及 Ly6Cmid单核细胞亚群的分化没有影响。葡萄糖以及甘露醇对Ly6Clow单核细胞亚群的分化没有影响。见图 1、表1。

图1 小鼠脾脏炎症单核细胞亚群分化的流式分析Fig.1 Flow cytometry analysis of inflammatory monocyte differentiation in primary cultured mouse splenocytes

表1 高糖促进小鼠脾脏炎症单核细胞亚群的分化Tab.1 High glucose promotes inflammatory monocyte differentiation in primary cultured splenocytes

2.2 高糖增加脾脏原代细胞中炎症单核细胞内ROS的产生

检测高糖干预后各单核细胞亚群中ROS水平，以DCF+表示各细胞亚群内ROS的水平。对照组中Ly6C+单核细胞亚群中 ROS 水平约是 Ly6C-单核细胞的 1.58 倍。15 mmol/L、25 mmol/L、35 mmol/L 葡萄糖干预显著增加 Ly6C+单核细胞亚群中 ROS 水平，分别 为 120% 、131% ，158%（P分 别 为 0.025、0.004、＜0.001），且具有浓度依赖性［25 mmol/L 较 15 mmol/L明显增加（P=0.003），35 mmol/L 较 25 mmol/L 明显增加（P=0.007）］。作为等渗对照的甘露醇组对Ly6C+单核细胞亚群中 ROS 的产生没有影响。葡萄糖及甘露醇均未能对Ly6C-单核细胞中ROS产生显著影响（图2、表2）。

2.3 利拉鲁肽抑制高糖诱导的脾脏原代细胞中炎症单核细胞亚群的分化

结果显示，25 mmol/L 的高糖使 Ly6Chi单核细胞亚群增加 143%（P=0.001），Ly6Cmid单核细胞亚群增加 126%（P=0.013），Ly6Clow单核细胞亚群没有变化（105%）。100 nmol/L 和 200 nmol/L 利拉鲁肽分别使高糖诱导的 Ly6Chi单核细胞亚群降到 122%和 105%（P分别为 0.001、0.040），Ly6Cmid单核细胞亚群降到118% 和 108%（P 分 别 为 0.013、0.030），并 且 200 nmol/L 与 100 nmol/L 利拉鲁肽比较 Ly6Cmid单核细胞降低更明显（P=0.042）。在 100 nmol/L 和 200 nmol/L利 拉 鲁 肽 的 干 预 下 ，Ly6Clow单 核 细 胞 亚 群 增 加 至115%和 123%（P分别为 0.009、＜0.001），见图 3、表3。

图2 Ly-6C+单核细胞亚群活性氧的流式测定Fig.2 Flow cytometry analysis of ROS production in Ly6C+monocytes

表2 高糖诱导下小鼠脾脏单核细胞中活性氧的测定Tab.2 High glucose enhances ROS production in Ly6C+monocytes in primary cultured splenocytes

2.4 利拉鲁肽能抑制脾脏原代细胞中炎症单核细胞内ROS的产生

检测利拉鲁肽干预后单核细胞亚群中ROS水平结果显示，25 mmol/L 的葡萄糖使 Ly6C+单核细胞中的 ROS 水平增加 123%（P=0.035）。 100 nmol/L和 200 nmol/L 利拉鲁肽分别使高糖诱导的 Ly6C+单核细胞中ROS水平减少，分别为87%和74%（P分别为 0.022、0.006），200 nmol/L 利拉鲁肽优于 100 nmol/L（P=0.041）。而 25 mmol/L 葡萄糖未能增加 Ly6C-单核细胞中 ROS水平。利拉鲁肽对 Ly6C-单核细胞中ROS的产生没有影响，见图4、表4。

3 讨论

图3 利拉鲁肽抑制高糖诱导的炎症单核细胞亚群分化的流式分析Fig.3 Flow cytometry analysis shows that liraglutide inhibits inflammatory monocyte differentiation induced by high glucose in primary cultured splenocytes

糖尿病患者的动脉粥样硬化病变出现早，程度重、且弥漫，前期研究［5］证实了不同单核细胞亚群对糖尿病动脉粥样硬化病变的贡献不同，但有关机制和干预方法尚不清楚。在本项研究中，利用体外培养的小鼠脾脏单核细胞观察到高糖刺激炎症单核细胞亚群分化，并能促进炎症单核细胞内ROS的产生。利拉鲁肽的干预可显著抑制高糖所诱导的炎症单核细胞亚群的分化，且能减少炎症单核细胞内ROS的生成。

循环中的单核细胞黏附、聚集到内皮下分化成巨噬细胞，促进动脉粥样硬化病变的发生发展［3-4］。最新研究［3-5］发现，单核细胞亚群根据其表面 Ly6C的表达可以 为 Ly6Chi、Ly6Cmid和 Ly6Clow，其中 Ly6Chi和 Ly6Cmid有促进动脉粥样硬化的作用，被称为炎症单核细胞亚群，而 Ly6Clow具有抑制动脉粥样硬化的作用。本研究首先证实了高糖可剂量依赖性促进Ly6Chi和 Ly6Cmid炎症单核细胞亚群的分化。进一步采用DCFH-DA标记细胞，通过流式细胞仪检测细胞内DCF的荧光强度测定细胞内ROS水平。结果显示，Ly6C+单核细胞亚群产生 ROS 水平显著高于Ly6C-单核细胞亚群，支持 Ly6C+单核细胞亚群为炎症单核细胞亚群，并参与机体氧化应激反应。高糖显著增加炎症单核细胞亚群中ROS的产生，提示高糖诱导炎症单核细胞亚群分化可能与氧化应激反应有关。

表3 利拉鲁肽对高糖诱导的小鼠脾脏单核细胞亚群的分化Tab.3 Liraglutide inhibits inflammatory monocyte differentiation induced by high glucose in primary cultured splenocytes

图4 利拉鲁肽抑制高糖所诱导的炎症单核细胞亚群内ROS的流式测定Fig.4 Flow cytometry analysis of ROS production in inflammatory monocytes induced by high glucose in primary cultured splenocytes

表4 利拉鲁肽抑制高糖所诱导的炎症单核细胞亚群内ROS的产生Tab.4 Liraglutide inhibits ROS production in inflammatory monocytes induced by high glucose in primary cultured splenocytes

利拉鲁肽作为一种新型的降糖药物，目前研究显示其具有抑制炎症反应［10-11］及拮抗氧化应激的作用［12-13］。本研究观察到利拉鲁肽可抑制高糖刺激下的炎症单核细胞亚群的分化，并促进单核细胞亚群向 Ly6Clow方向分化，为利拉鲁肽抗动脉粥样硬化病变的机制提供线索。利拉鲁肽可显著抑制高糖所诱导的 Ly6C+单核细胞亚群中 DCF+细胞的数量、而对 Ly6C-单核细胞中 DCF+细胞数量无影响，说明利拉鲁肽干预选择性抑制了炎症单核细胞亚群中ROS的产生。ROS作为氧化应激损伤的主要标志物，其减少意味着氧化应激反应被抑制，提示利拉鲁肽有可能通过抗氧化作用减少高糖所诱导的炎症单核细胞亚群的分化，并减少高糖条件下氧化应激反应。

综上所述，新型降糖药物利拉鲁肽可抑制高糖所诱导的炎症单核细胞亚群分化，并减少ROS的产生，提示利拉鲁肽可有效干预高糖所致炎症单核细胞的分化、且可能与抑制氧化应激反应有关，本研究为糖尿病动脉粥样硬化病变的防治开辟新的思路。

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（编辑 武玉欣）

Liraglutide Inhibits Inflammatory Monocyte Differentiation Induced by High Glucose

SHEN Yali，JIANG Kun，ZHANG Minli，SU Yanhong，ZHANG Daqing
（Department of Cardiology，Shengjing Hospital，China Medical University 110004，China）

ObjectiveTo explore the mechanism by which liraglutide modulated the differentiation of monocyte subsets in high glucose（HG）conditions.MethodsPrimary mouse splenocyte suspensions were cultured in HG conditions induced by IFN-γ in the presence or absence of liraglutide.The cells were harvested，co-incubated with antibodies，and analyzed on a BD FACS Calibur.Mononuclear cells（MNCs）were gated according to lower granularity and larger size by SSC and FSC.Monocytes（MCs）were defined as CD11b+MNC and divided into three subsets based on Ly6C expression：Ly6Clow，Ly6Cmid，and Ly6Chi.ROS production in Ly6C+and Ly6C-MCs was detected by 2’，7’-dichlorofluorescein-diacetate（DCFH-DA）staining and ROS-containing MCs were identified as DCF+cells in both Ly6C+and Ly6C-MCs.ResultsHG（15 mmol/L，25 mmol/ L，35 mmol/L）dose-dependently increased Ly6Chiand Ly6CmidMC differentiation and also enhanced the production of ROS in Ly6C+MCs.Liraglutide（100 U，200 U）dose-dependently inhibited HG-induced Ly6Chiand Ly6CmidMC differentiation and also promoted the differentiation of Ly6ClowMCs.Moreover，liraglutide significantly inhibited HG-induced ROS production in Ly6C+MCs.ConclusionLiraglutide treatment significantly inhibited inflammatory MC differentiation induced by HG and also reduced ROS production in inflammatory MCs.

liraglutide；diabetes mellitus；oxidative stress；inflammatory monocyte

R541.4

A

0258-4646（2017）09-0773-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170906.1317.004.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.09.002

国家自然科学基金（81200199）；辽宁省高等学校杰出青年学者成长计划（LJQ2015117）

申亚丽（1989-），女，医师，硕士研究生.

张大庆，E-mail：zhangdaqing@vip.163.com

2016-12-09

网络出版时间：2017-09-06 13:17