槲皮素PLGA-TPGS纳米粒对小鼠肝癌异位实体瘤治疗效果的研究

徐红，张成鸿，关欣，董浩，徐荣谦，陈雨，高萌，田燕

（大连医科大学 1. 基础医学院机能学实验室；2. 药学院药剂学教研室；3. 八年制2016级临床医学专业，辽宁 大连 116044）

槲皮素PLGA-TPGS纳米粒对小鼠肝癌异位实体瘤治疗效果的研究

徐红1，张成鸿1，关欣2，董浩2，徐荣谦3，陈雨3，高萌2，田燕2

（大连医科大学 1. 基础医学院机能学实验室；2. 药学院药剂学教研室；3. 八年制2016级临床医学专业，辽宁 大连 116044）

目的考察槲皮素 PLGA-TPGS 纳米粒（QPTN）在体内对荷腹水型肝癌高淋巴道转移细胞 HCa-F 小鼠异位移植实体瘤的治疗效果。方法建立荷 HCa-F 肝癌细胞小鼠模型后，随机分为阴性对照组、空白纳米粒组、5-氟尿嘧啶溶液（FS）组、槲皮素溶液（QTS）组、槲皮素 PLGA 纳米粒（QPN）组和 QPTN 组。尾静脉给药，每 2 d 1 次，连续给药 20 d 后处死小鼠，剥离肿瘤，称质量，测量肿瘤体积，根据公式计算肿瘤体积增长量和抑瘤率；行HE染色观察肿瘤，全面评价QPTN对荷瘤小鼠的治疗效果。结果小鼠体内给药 10 次后，QPTN 组、QPN 组、FS 组的肿瘤体积增长量与阴性对照组相比明显减小（P ＜ 0.05 或P ＜ 0.01），QPTN 组抑瘤率（59.07%）明显高于 QTS 组（23.94%）、FS 组（35.14%）和 QPN 组（46.14%）。HE 染色结果也显示 QPTN 组对小鼠肿瘤的治疗效果最明显。结论与QPN、QTS和FS相比，QPTN对荷HCa-F肝癌细胞小鼠异位实体瘤具有较好的治疗效果。

槲皮素；纳米粒；小鼠；肿瘤；HCa-F肝癌细胞；抑瘤率

肝癌是最常见的、死亡率较高的恶性肿瘤之一［1］。采用纳米粒（nanoparticles，NPs）等靶向给药系统不仅可增加药物对肿瘤组织的靶向性，减少用药量，从而降低对正常细胞的毒性，还可改变药物的体内溶解性和体外稳定性，提高其在靶部位的生物利用度，是目前常见的肝癌治疗手段之一［2］。槲皮素（Quercetin，QT）主要分布在槐花、丹皮、菊花等多种植物的花、叶、果实中，来源非常广泛，具有抗炎、抗病毒、抗肝癌等多种药理作用［3-7］。本研究拟建立荷腹水型肝癌高淋巴道转移细胞HCa-F小鼠异位移植肿瘤模型［8］，采用自制材料乳酸羟基乙酸共聚物-维生素 E 聚乙二醇 1000 琥珀酸酯（polylacticco-glycolic acid tocopherol polyethylene glycol 1000 succinat，PLGA-TPGS）为载体，制备 QT 纳米粒（QT-loaded PLGA-TPGS NPs，QPTN），并 以 市 售 材 料PLGA 为 载 体 制 备 的 QT PLGA 纳 米 粒（QT-loaded PLGA NPs，QPN）作对照，通过计算给药后肿瘤体积增长量、抑瘤率（tumor inhibition rate，TIR）、瘤内 QT含量和观察肿瘤切片苏木素和曙红（HE）染色，定量、定性地全面考察QPTN对小鼠体内异位实体瘤的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：QT 对照品（中国药品生物制品检定所，批号 100081-200907，纯度 99%）；QT（美仑生物公司，批号 20140105，纯度 96%）；QPTN（药剂学教研室自制，批号 20140910，QT：215 mg/g）；QPN（药剂学教研室自制，批号 20140910，QT：150 mg/g）；5-氟尿嘧啶注射液（25 mg/mL，上海旭东海普药业有限公司，批号1402181）；香兰素（分析纯，北京化学试剂公司，批号010901，纯度99%）。

1.1.2 细胞株：小鼠腹水型高淋巴道转移 HCa-F 细胞株由大连医科大学形态学实验室提供。

1.1.3 实验动物：健康 8 周龄昆明种小鼠（SPF 级），体质量 20～25 g，由大连医科大学实验动物中心提供，许可证号 SCXK（辽）2008-0002。

1.2 方法

1.2.1 瘤内测定 QT 的色谱条件：色谱柱为 Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长为 360 nm；流速为 0.8 mL/min；流动相为乙腈∶0.3%磷酸水溶液（33∶67）；柱温为 30 ℃；进样量为 20 μL。

1.2.2 动物分组及给药方案：参考文献［8］建立荷HCa-F细胞小鼠肝癌异位实体瘤模型，将实体瘤长径（12～15 mm）符合要求的小鼠随机分为阴性对照组、空白纳米粒（EPTN）组、5-氟尿嘧啶溶液（5-fluorouracil solutions，FS）组、槲皮素溶液（QTS）组、QPN组和QPTN组，每组8只，采用尾静脉给药方式，每2 d 给药 1 次，持续给药 20 d。阴性对照组注射含 20% PEG40 的 生理盐水溶液 0.2 mL；EPTN 组注射不 含QT的空白纳米粒，材料及浓度与QPTN相同；FS组注射 FS（取 25 mg/mL 的 5-氟尿嘧啶溶液 1 mL 置 10 mL量瓶中，加入含20%PEG400的生理盐水溶液定容 至 刻 度）10 mg/kg；QTS 组 注射 QTS（取 QT 12.50 mg置 10 mL 量瓶中，加入含 20%PEG400 的生理盐水溶液溶解、定容至刻度）10 mg/kg；QPN 组、QPTN组 分 别 注 射 相 当 于 10 mg/kg QT 的 QPN 混 悬 液 或QPTN 混悬液（取 QPN 82.78 mg 或 QPTN 57.87 mg置10 mL量瓶中，加入含20%PEG400的生理盐水溶液分散、定容至刻度，注射前在100 W超声条件下超声1 min 后备用）。

1.2.3 检测指标：

1.2.3.1 肿瘤体积增长量 在给药前后，用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长径及短径，计算肿瘤体积［体积=长径×（短径）2/2］和实体瘤体积增长量（实体瘤体积增长量=给药后实体瘤体积-给药前实体瘤体积）。

1.2.3.2 小鼠体质量监测 给药期间在每次给药前测定每只小鼠的体质量，按照实际体质量调整给药剂量，并记录各组小鼠体质量变化。

1.2.3.3 TIR 在停药次日，颈椎脱位法处死小鼠，小心剥离瘤体，称质量。计算 TIR（%）=（阴性对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量）/阴性对照组平均瘤质量×100。

1.2.3.4 瘤内 QT 含量的测定 （1）QT 和香兰素对照贮备液的配制。取干燥至恒重的 QT 对照品 5.0 mg，用甲醇溶解、定容至 50 mL，配成浓度为 100 μg/mL的 QT 对照贮备液。取香兰素对照品 25.0 mg，加甲醇溶解、定容至 10 mL，配成浓度为 2.5 mg/mL 的内标对照贮备液，4 ℃贮存备用。（2）QT 系列浓度对照溶液的配制。取 QT 对照贮备液 5、10、20、40、80、160、320 μL 于 10 mL 量瓶中，分别加入香兰素内标对照贮备液 100 μL，加甲醇定容至刻度，配成浓度为 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL 的 QT 系列对照溶液（含香兰素 25.0 μg/mL），4 ℃贮存备用。（3）QT标准曲线的绘制。随机选取阴性对照组的2只小鼠，剖取实体瘤后称质量，加入4倍量的生理盐水后研磨成匀浆。量取实体瘤匀浆 400 μL 7 份，分别置 5 mL 离心管中，每份分别加入 QT 系列浓度对照溶液 100 μL，涡旋 1 min 混合均匀，加入乙酸乙酯 2 mL 萃取，涡旋混合 1 min，10 000 r/min 离心 10 min。分离出有机层并用氮气流吹干，残留物加入甲醇0.2 mL 复溶，涡旋 1 min 后，按 1.2.1 色谱条件测定。（4）瘤内 QT 含量的测定。随机选取 QTS、QPN、QPTN组中的6只小鼠，剖取实体瘤，称质量，加入4倍量的生理盐水后研磨成匀浆，按照 1.2.1 色谱条件测定QT与内标峰面积，再计算QT含量。

1.2.3.5 标本采集与 HE 染色处理 随机选取 2 个称质量后的肿瘤，切取适宜部位的组织并将其及时固定在 10%中性甲醛缓冲液中，固定 24 h，冲洗、脱水透明、浸蜡、包埋并制石蜡切片，行HE染色，观察肿瘤组织形态学的改变。

1.3 统计学分析

采用 SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析。数据用x± s表示，采用方差分析比较多组资料，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瘤内测定QT的色谱条件

在 1.2.1 色谱条件下，QT 与其他各组分峰和内标物香兰素（1.0 μg/mL）色谱峰能达到基线分离，空白小鼠肿瘤匀浆对样品的测定均无干扰，保留时间分别为 7.2 min、5.1 min，理论板数按 QT 峰计算不低于 3 000，其肿瘤匀浆的色谱图见图1。以QT 与香兰素峰面积（A）的比值对浓度C进行线性回归，得到肿瘤匀浆中 QT 的标准曲线方程为 A=0.058 4C+ 0.008，r=0.9991。结果表明，QT 在肿瘤匀浆中 0.5～32.0 μg/mL 范围内线性关系良好。以信噪比为 3 和10作为QT的检测限与定量限，测得二者分别为 0.3 μg/mL 与 0.5 μg/mL，方法学考察结果均符合相关规定。

图1 QT的反相高效液相色谱图Fig.1 RP-HPLC images of QT

2.2 小鼠体质量的监测

给药期间各组小鼠的体质量均有一定程度的增长（图2），其中，阴性对照组和EPTN 组小鼠增长较明显；QPTN组小鼠的体质量改变相对较小，但与阴性对照组和EPTN组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；各 组 之 间 比 较 ，差 异 无 统 计 学 意 义（P ＞ 0.05）。

图2 荷瘤小鼠给药期间体质量变化（n=8）Fig.2 The average body weight of the mice in each group during the administration period（n=8）

2.3 肿瘤体积增长量和TIR 的测定结果

给药前后小鼠肿瘤体积增长量和TIR测定结果见表1。结果表明，给药后，FS组、QPN组、QPTN组的肿瘤体积增长量与阴性对照组相比具有统计学差异（P＜ 0.05），说明这 3 组均能在不同程度上抑制肿瘤的生长，QTS组也有一定程度的减小，但与阴性对照组相比差异无统计学意义，而EPTN组没有明显效果。与QTS组相比，QPTN组、QPN组抑制肿瘤生长的效果更为明显，小鼠肿瘤体积增长量分别降低了 1.57、0.93 cm3，但差异无统计学意义；TIR 分别增加了 35.13%、22.14%，且 QPTN 效果更显著，TIR较 QPN 组增加了 12.93%，肿瘤体积增长量减少了0.64 cm3。与 FS 组相比，QPTN 组、QPN 组对肿瘤的抑制作用也相对更明显，2组小鼠肿瘤体积增长量比 FS 组分别降低了 1.48、0.84 cm3，但差异无统计学意义，TIR 分别增加了 23.93%、11.00%，表明自制纳米粒组比市售的5-氟尿嘧啶注射液对荷瘤小鼠肿瘤的生长具有更好的抑制效果。

2.4 肿瘤内QT含量的测定

表1 给药前后肿瘤体积增长情况、抑瘤率及瘤内QT含量Tab.1 Tumor volumes，tumor inhibition rates，and QT content in each group（

表1 给药前后肿瘤体积增长情况、抑瘤率及瘤内QT含量Tab.1 Tumor volumes，tumor inhibition rates，and QT content in each group（

1）P ＜ 0.05，2）P ＜ 0.01 vs the negative control group and EPTN group，respectively；3）P ＜ 0.05 vs corresponding QTS group；4）P ＜ 0.05，5）P ＜ 0.01 vs corresponding QTS group，respectively.TIR，tumor inhibition rate.

Group Volume of tumor（cm3，n=8） Tumer weight TIR Content of QT in tumor（n=6）Before administration After administration Volume growth （g，n=8） （%） （μg） （μg/g）Negative control 0.38±0.07 6.40±1.39 6.02±1.45 5.18±1.12 - - -EPTN 0.41±0.08 6.19±1.32 5.78±1.16 5.05±1.07 2.51 - -FS 0.43±0.09 3.68±1.16 3.25±0.511） 3.36±0.651） 35.14 - -QTS 0.42±0.08 3.76±1.05 3.34±0.74 3.94±0.58 23.94 3.26± 0.24 0.83± 0.05 QPN 0.41±0.06 2.82±0.91 2.41±0.471） 2.79±0.521） 46.14 20.18±0.935） 7.23±0.684）QPTN 0.44±0.08 1.21±0.52 1.77±0.321），3） 2.12±0.282），3） 59.07 28.41±1.375） 13.40±1.095）

采用 RP-HPLC 法测定 QTS、QPN和 QPTN 组小鼠给药后肿瘤内的QT含量，结果见表1。可见2个纳米粒组瘤内QT含量均比QTS组高，差异有统计学意义（P ＜ 0.05 或P ＜ 0.01）。

2.5 HE染色

图3 代表性的HCa-F细胞肝癌实体瘤组织切片 HE ×400Fig.3 Representative images of HCa-F hepatocarcinoma solid tumors HE×400

将称质量后的肿瘤切片行HE染色、镜检，典型图片结果见图3。阴性对照组（图3A）肿瘤细胞形态完整，生长旺盛、浆少核大，多为单核或多核，位于细胞中央位置。EPTN组（图3B）与阴性对照组无明显差异，细胞数量多、排列紊乱、密集成团。FS组（图3C）肿瘤组织内出现大面积的坏死区域，细胞核的颜色逐渐变浅。与QTS组（图3D）相比，QPTN组（图3F）有更多的破碎和结构不完整的细胞出现，边缘形态较为模糊，而QPN组（图3E）介于二者之间，可见纳米粒较QT溶液抑制肿瘤的效果更加显著。结果表明，无论从肿瘤体积增长量、TIR定量方面，还是从病理学切片定性方面，QPTN对肿瘤的治疗效果最好，其次是QPN，且纳米粒载体材料PLGATPGS对肿瘤生长无明显的抑制作用（图3B）。

3 讨论

本研究组在预实验中曾采用 1 次/d 的给药频率，结果FS组小鼠在第4天出现死亡，其他组小鼠（尤其 QTS 组）精神状态不佳，故改为每 2 d 1 次尾静脉给药，连续给药20 d。同时，延长给药间隔使纳米粒可以更加完全地发挥其缓释作用，从而达到更好的治疗效果。

本研究结果显示，与其他组相比，QPTN对荷HCa-F细胞小鼠肝癌异位实体瘤具有良好的治疗效果。分析其原因是由于QPTN粒径较小、表面带负电荷（绝对值较大），具有较好的被动靶向性，并且PLGA-TPGS是两亲性载体材料，本研究前期采用超声乳化—溶剂挥发法制备的QPTN属于纳米球型纳米粒，模型药物QT可以分子或无定型粉末状态高度分散在载体材料中，材料在体液或细胞质中溶解较慢，故有很好的缓释作用；同时，由于TPGS具有一定的水溶性，材料在体内可以逐渐溶解和降解，故可将药物更完全地释放出来、更好地发挥其抗肿瘤作用［9-11］。与 QTS 组和 FS 组比较，QPTN 和 QPN 这 2种纳米粒对肿瘤都发挥了较好的治疗效果，这是因为纳米粒在体内能缓慢而持续地释放药物，能被肿瘤细胞更好地摄取，对肿瘤组织具有良好的靶向作用［9-11］，而 QTS 和 FS 静脉注射给药后没有选择性和缓释性，故治疗效果不如纳米粒组。在2种纳米粒中，QPTN对肿瘤生长的抑制作用比QPN好，这是由于与QPN相比，QPTN具有更小的粒径，更高的载药量，可以被肿瘤细胞摄取的更多，进入细胞内的QT量也更大，同时，制备QPTN的自制载体上所连接的TPGS不仅可降低肿瘤细胞内P-糖蛋白介导的多药耐药性，减少 QT 从细胞中外排［12］，加强 QT 的吸收，还由于TPGS具有良好的亲水性，可以使QT在细胞内释放、溶解的更多，从而更好地发挥对肿瘤的治疗作用。

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（编辑 王又冬）

The Therapeutic Effect of Quercetin-loaded PLGA-TPGS Nanoparticles on the Hepatocarcinoma Ectopic Solid Tumor-bearing Mice

XU Hong1，ZHANG Chenghong1，GUAN Xin2，DONG Hao2，XU Rongqian3，CHEN Yu3，GAO Meng2，TIAN Yan2

（1.Laboratory of Medical Function，College of Basic Medical Sciences，Dalian Medical University，Dalian 116044，China；2.Department of Pharmaceutics，College of Pharmacy，Dalian Medical University，Dalian 116044，China；3.Students at Grade 2016 in Clinical Medical Eight Grade，Dalian Medical University，Dalian 116044，China）

ObjectiveTo investigate the therapeutic effects of Quercetin（QT）-loaded PLGA-TPGS nanoparticles（QPTN）on solid tumor-bearing mice with HCa-F hepatocarcinoma in vivo.MethodsThe model of HCa-F hepatocarcinoma solid tumor-bearing mice was established by implanting HCa-F cells into 48 mice.The mice were divided into 6 groups randomly：the negative control，empty PLGA-TPGS nanoparticles，5-Fluorouracil solutions（FS），Quercetin solutions（QTS），QT-loaded PLGA nanoparticles（QPN），and QPTN groups.Each group was treated using tail vein twice a day for 20 days；then，all mice were sacrificed.The increment tumor volumes and tumor growth inhibition rate were counted.Then，tumor specimens were prepared for hematoxylin&eosin（HE）staining and observed under a microscope.ResultsThe results showed that the increment tumor volumes of mice in the QPTN，QPN，and FS groups were significantly smaller than that in the negative control group（P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01）.The tumor growth inhibition rate of the QPTN group was 59.07%，which was much higher than that of the QTS group（23.94%），the FS group（35.14%），and the QPN group（46.14%）.The results of the HE staining on the tumor sections also indicated that the QPTN group showed a better therapeutic outcome compared to the other groups.ConclusionThe QPTN has a better therapeutic effect on the model of solid tumor using HCa-F cells-bearing mice than the QPN，QTS，and FS.

Quercetin；nanoparticles；mice；tumor；HCa-F hepatocarcinoma cells；tumor growth inhibition rate

R944.9

A

0258-4646（2017）09-0791-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170906.1318.010.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.09.006

辽宁省自然科学基金（2015020308）

徐红（1970-），女，实验师，本科.

田燕，E-mail：tiany2004@126.com

2016-12-08

网络出版时间：2017-09-06 13:18