MTHFRC677T、MTHFRA1298C和MTRRA66G基因的多态性与急性髓系白血病的相关性分析

王琪，符爽，傅煜，张继红

（1.中国医科大学附属盛京医院血液研究室，沈阳 110022；2. 辽宁中医药大学附属第三医院检验科，沈阳 110003）

MTHFRC677T、MTHFRA1298C和MTRRA66G基因的多态性与急性髓系白血病的相关性分析

王琪1，2，符爽1，傅煜1，张继红1

（1.中国医科大学附属盛京医院血液研究室，沈阳 110022；2. 辽宁中医药大学附属第三医院检验科，沈阳 110003）

目的探讨MTHFRC677T、MTHFRA1298C以及MTRRA66G的基因多态性与急性髓系白血病（AML）的相关性。方法应用实时PCR方法检测并分析63例AML患者以及60例正常对照者MTHFRC677T、MTHFRA1298C以及MTRRA66G的多态性。结果对2组患者进行MTHFRC677T、MTHFRA1298C以及MTRRA66G基因多态性分析，得出3个位点的等位基因多态性与AML不存在必然联系。MTHFRC677T、MTHFRA1298C以及MTRRA66G单倍型基因分析结果表明，MTRR66位G等位基因在对照组中有所增多，与 MTRR66 位 A 等位基因相比增加了 1.935 倍（95%Cl：1.061～3.530，χ2=4.708，P ＜ 0.05）。将 2 组人群的基因型进行 3 个位点的整合，突变状况分析结果显示其与 AML 也无必然联系。结论MTHFRC677T、MTHFRA1298C和MTRRA66G基因多态性与AML无明显相关性。

MTHFRC677T；MTHFRA1298C；MTRRA66G；基因多态性；叶酸；急性髓系白血病

急 性 髓 系 白 血 病（acute myelocytic leukemia，AML）是造血系统恶性肿瘤。60岁及以下AML患者的治愈率为35%～40%，60岁以上老年AML患者治愈率仅为 5%～15%［1］。亚甲基四氢叶酸还原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是机体内叶酸代谢通路的关键酶之一。MTHFR基因位点的多态性突变会降低酶的活性，使基因组产生断裂和异常［2］，进而影响肿瘤抑制因子及致癌基因的表达，发生肿瘤性疾病。甲硫氨酸合成还原酶（5-methyltetrahydrofolate homocysteine methyltransferase reductase，MTRR）的主要作用是催化甲硫钴胺，从而保持甲硫氨酸合成酶的活性。其基因多态性能降低酶的活性，使机体内同型半胱氨酸的水平产生波动［3-4］，从而引发肿瘤。其基因位点的突变能引起DNA链断裂、染色体重排和不分离，从而破坏DNA 的甲基化，为引发癌症的风险因子之一［5-7］。近年 来 ，有 研 究［8-9］分别 证 实 了 MTHFR的 rs1801133（C677T）及 rs1801131（A1298C）和MTRR的 rs1801394（A66G）的基因突变与多种癌症（包括肺癌、上呼吸道肿瘤、胃癌和结肠癌）的发生存在易感性关联。更有研究［10-12］表明，MTRR（A66G）与急性淋巴性白血病（acute lympholastic leukemia，ALL）的发生有显著相关性。本研究分析了MTHFR、MTRR的以上3个基因位点与AML的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本收集

选取中国医科大学附属盛京医院滑翔院区2013年1月至2016年1月被确诊为AML的患者63例作为患者组，同时选取同一时间段未患任何肿瘤的60例成年人作为对照组。

1.2 方法

1.2.1 单个核细胞和基因组 DNA 提取：取骨髓或者外周血标本。离心吸取中间单个核细胞层，移入装有红细胞裂解液（北京天根生化科技有限公司）的试管中，按试剂说明书步骤提取基因组DNA。

1.2.2 基 因 组 DNA 提 取 ：采 用 TIANamp genomic DNA kit离心柱型试剂盒（北京天根生化科技有限公司），按照说明书进行操作。

1.2.3 MTHFR（C677T、A1298C）以及MTRRA66G基因多态性检测［13］：采用实时 PCR 体外扩增的方法，利用实时荧光寡核苷酸探针，通过比较野生型引物和突变型引物扩增的Ct值变化，判断标本的基因型。仪器为ABI 7500荧光PCR 检测仪。 试剂盒（上海源奇生物医药科技有限公司）中包括MTHFR基因 的 rs1801133 和 rs1801131 位 点 ，MTRR 基 因 的rs1801394 位点特异性引物、荧光探针以及 Taq 酶等成分。反应体系 25 μL，由反应液（特异引物和探针）9 μL+叶酸混合液（4种脱氧核糖核苷三磷酸、氯化钾、氯化镁、缓冲液）13 μL+3 μL 各阴、阳对照及待测样本组成。反应条件为 42 ℃ 5 min，94 ℃预变性 3 min，94 ℃ 15 s，64 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，共 48 个循环。

1.3 统计学分析

采用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验，用于比较2组基因型及等位基因的分布差异，并分析样本基因型是否符合 Hardy-Weinberg平衡定律。基因多态性与 AML 风险关系采用比值比（oddis radio，OR）及其 95%可信区间（confidenceinterval，CI）来描述，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组一般资料

病例组与对照组性别和年龄分布见表1。2组人群性别和年龄差异均无统计学意义。（P ＞ 0.05）

表1 2组性别和年龄分布［n（%）］Tab.1 Distribution of the two groups based on sex and age［n（%）］

2.2 MTHFR（C677T、A1298C）以及 MTRRA66G基因多态性与AML的关系统计数据的结果与分析（表2）

2.2.1 MTHFRC677T基因多态性与 AML 的关系统计数据的结果与分析：病例组中MTHFRC677TCC、CT、TT 3 种基因型分布频率分别为 20.7%、42.8%和36.5%。其分布符合 Hardy-Weinberg平衡定律。对照组分别为 18.4%、43.3%和 38.3%，3 种等位基因在2组人群的频率分布未见统计学意义。

2.2.2 MTHFRA1298C基因多态性与 AML 的关系统计数据的结果与分析：病例组中 MTHFRA1298C AA、AC、CC 3 种 基 因 型 分 布 频 率 分 别 为 82.5% 、12.7%和 4.7%，分布符合 Hardy-Weinberg 平衡定律。

2.2.3 MTRRA66G基因多态性与 AML 的关系统计数据的结果与分析：病例组中MTRRA66G为 71.4%（AA）、20.6%（AG）、7.9%（GG），分 布 符 合 Hardy-Weinberg 平衡定律。与对照组相比分布无统计学差异。

表2 2组中MTHFRC677T、MTHFRA1298C以及MTRRA66G多态位点基因型分布频率及其与AML相关性Tab.2 Relationship of the distribution frequency of MTHFRC677T，MTHFRA1298C，and MTRRA66G gene polymorphisms with acute myelocytic leukemia

2.2.4 MTHFRC677T、MTHFRA1298C以及MTRRA 66G单倍型分析：从单倍型分析的结果来看，2组人群中携带含有MTHFRC677TT等位基因和含有C等位基因相比，等位基因在2组人群的频率分布未见统计学差异；携带含有MTHFRA1298CC等位基因与含有A等位基因相比，3种等位基因在2组人群的频率分布无统计学差异；携带含有MTRR66G等位基因和含有MTRR66A等位基因相比，AML患病率增加了 1.93 倍（95%CI：1.06 ～3.53），有统计学差异（χ2=4.70，P ＜ 0.05）。

根据 MTHFR（C677T、A1298C）以及MTRRA66G基因型的纯杂合突变情况，分为高度、中度、低度和无风险 4 组［14-16］，见表 3。病例组高度风险患者 5 例（7.9%），对照组不存在高度风险患者，病例组与对照 组 相 比 ，高 度 风 险 患 者 明 显 增 多（χ2=3.13，P ＜0.05）；病例组低度风险患者 33 例（52.4%），对照组低度风险29例（48.3%），2组低度风险相比差异无统计学意义（χ2=0.20，P ＞ 0.05）；病例组中无风险患者4 例（6.3%），对照组无风险者 1 例（1.7%），2 组差异无统计学意义（χ2=0.73，P＞ 0.05）；病例组中，中度风险患者 21 例（33.3%），对照组中度风险患者 30 例（50%），2 组差异无统计学意义（χ2=3.51，P ＞ 0.05），见表4。

3 讨论

人体正常细胞基因组有着其特有的甲基化模式，这种模式被破坏则会导致DNA甲基化修饰异常，MTHFRC677T、MTHFRA1298C以及MTRRA66G这 3 个位点在此过程中起很大作用。研究［17］表明，体内叶酸含量不足时，细胞基因组DNA出现低甲基化，c-myc、c-fos等原癌基因 mRNA 水平的增加，补充之后，上述情况都恢复正常。另外，叶酸缺乏将导致sn-RNA甲基化水平降低，影响mRNA的正常发育成熟［18］。在保护 DNA 完整性方面，叶酸以其特有的甲基原料保证着dTMP的数量，使尿嘧啶的错误渗入减少［19］。已经有动物研究［20］阐述，叶酸缺乏会导致实验大鼠的P53基因编码区的低水平甲基化，而这些低水平甲基化位点是P53突变发生最常见的位置。研究［21］表明，MTHFR677TT在双侧乳腺癌患者和既患乳腺癌又患卵巢癌的患者中的表达，比只患单侧乳腺癌或只患仅一种上述癌症的患者明显增多。

表3 MTHFRC677T，MTHFR A1298C以及MTRRA66G 基因型风险等级Tab.3 Risk classification of MTHFRC677T，MTHFRA1298C，and MTRRA66G gene polymorphisms

表4 MTHFR（C677T、A1298C）以及MTRRA66G基因型风险等级分布频率［n（%）］Tab.4 Frequency distribution of MTHFRC677T，MTHFRA1298C，and MTRRA66G polymorphisms according to the grade of risk［n（%）］

本研究的结果可以看出，叶酸相关基因的多态性也和AML存在一定关系，MTRR66G等位基因和MTRR66A等位基因相比，AML患病率有所增加。根据3个位点基因型风险度分析发现，高度风险患者患AML概率明显增加，但因人数过少，属于小概率事件，故不能得出相关结论。

综上所述，MTHFRC677T、MTHFRA1298C以及MTRRA66G基因多态性与AML发生的关系仍需进一步摸索，本研究的结论并不能证明二者存在必然联系，究其原因可能是样本数量偏少，在以后的研究中应进一步结合其他因素（如饮食习惯、环境因素等），用流行病学的办法来分析环境基因交互作用 。 鉴 于 MTHFRC677T、MTHFRA1298C 以 及MTRRA66G基因对叶酸的代谢有重要作用，叶酸摄取量以及体内相关物质也应一起纳入分析，以便更加 全 面 地 评 价 MTHFR（C677T、A1298C）以 及MTRRA66G基因多态性对肿瘤的影响，为早期预防肿瘤提供依据。

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（编辑 于 溪）

Relationship of the MTHFRC677T，MTHFRA1298C，and MTRRA66G Gene Polymorphisms with Acute Myelocytic Leukemia

WANG Qi1，2，FU Shuang1，FU Yu1，ZHANG Jihong1

（1.Department of Hematology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110022，China；2.Department of Clinical Laboratory Medicine，The Third Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110003，China）

ObjectiveTo investigate the relationship of theMTHFRC677T，MTHFRA1298C，andMTRRA66Ggene polymorphisms with acute myelocytic leukemia（AML）.MethodsMononuclear cells were collected from 63 patients diagnosed with AML，and 60 healthy，non-AML control-group patients.DNA extracted from each sample was screened for theMTHFRC677T，MTHFRA1298C，andMTRRA66Gpolymorphisms.ResultsNo significant difference was observed in the distribution of theMTHFRC677T，MTHFRA1298C，and/orMTRRA66Gpolymorphisms between the two patient groups.In contrast，the MTRR G allele was observed to occur 1.935 times more frequently than the MTRR an allele（χ2= 4.708，P ＜ 0.05，95%CI：1.061-3.530）.No significant difference was observed in the distribution of a combination of the three gene polymorphisms（MTHFRC677T，MTHFRA1298C，andMTRRA66G）between the AML and the control group.ConclusionThe results of the present study suggest that theMTHFRC677T，MTHFRA1298C，andMTRRA66Gpolymorphisms are not associated with AML.

MTHFRC677T；MTHFRA1298C；MTRRA66G；gene polymorphism；folic acid；acute myelocytic leukemia

R446.1

A

0258-4646（2017）09-0779-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170906.1317.006.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.09.003

国家自然科学基金（81300420）

王琪（1984-），女，主管检验师，本科.

张继红，E-mail：zhangjh1@sj-hospital.org

2017-01-05

网络出版时间：2017-09-06 13:17