阻塞性睡眠呼吸暂停综合征模型大鼠心肌氧化应激的损伤及复氧后的变化

田培燕，陈应康，谢福珊，杨顺茂

（黔南民族医学高等专科学校1.生理教研室，2.病理学教研室 贵州 黔南 558000；3.贵州医科大学第三附属医院 老年科 贵州 黔南 558099）

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征模型大鼠心肌氧化应激的损伤及复氧后的变化

田培燕1，陈应康2，谢福珊1，杨顺茂3

（黔南民族医学高等专科学校1.生理教研室，2.病理学教研室 贵州 黔南 558000；3.贵州医科大学第三附属医院 老年科 贵州 黔南 558099）

目的通过复制阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAHS）的间歇缺氧（IH）大鼠模型，观察IH对大鼠心肌氧化应激的损伤及其复氧后的变化情况。方法40只SD大鼠随机分为4组，对照组（A组）10只，复制30只阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的间歇缺氧大鼠模型，其中10只缺氧组（B组），10只缺氧后复氧组（C组），另外10只持续缺氧组（D组）。检测各组大鼠血清中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，以及心肌组织中还原型谷胱甘肽（GSH）活性。结果与对照组大鼠比较，IH模型大鼠MDA含量增高，SOD活性降低，心肌组织GSH活性降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；复氧组大鼠MDA、SOD和心肌组织GSH活性恢复正常，差异无统计学意义（P＞0.05）；而D组大鼠MDA含量增高，SOD活性降低，心肌组织GSH活性降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论OSAHS存在氧化应激，严重损伤心肌组织，缺氧时MDA含量、SOD和GSH活性改变，复氧后有所恢复。血清MDA含量、SOD活性及心肌组织GSH活性可以反应氧化应激的严重程度。

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征；间歇缺氧；持续缺氧；心肌氧化应激

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea hyperpnoea syndrome，OSAHS），是一种严重危害人类健康的常见性呼吸系统疾病，发病率日趋升高，日益受到医学界的重视[1-2]。OSAHS是指患者在睡眠时引发通气不足和呼吸暂停，伴随睡眠结构紊乱、打鼾等，继而引发一系列生理病理改变和临床并发症[3-4]。OSAHS患者多表现为白天嗜睡，夜间反复发生低氧血症和高碳酸血症，睡眠时打鼾并伴有呼吸浅表和呼吸暂停。OSAHS患者在呼吸暂停、组织缺氧后，又发生高通气血氧恢复，该过程产生过多的氧自由基进而改变氧平衡，导致氧化应激（oxidative stress，OS）发生，氧化和抗氧化能力失衡[5-6]。研究证实诸多疾病的发生发作都与OS相关，尤其与心血管疾病有密切联系。因此，本研究复制OSAHS的间歇缺氧（intermittent hypoxia，IH）大鼠模型，探讨是否存在氧化应激及其可能导致的损伤。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

1.1.1 实验动物 40只清洁级雄性SD大鼠（由重庆市中药研究院实验动物研究所提供），体重200～220 g，随机分为 4组，即对照组（A 组）、缺氧组（B组）、缺氧复氧组（C组）和持续缺氧组（D组），每组10只。所有动物均由统一饲料喂养。

1.1.2 实验试剂 戊巴比妥钠购自北京普博斯生物科技有限公司，青霉素购自山西振东泰盛制药有限公司，丙二醛（Malonaldehyde，MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 动物模型的复制

选用一个长方体箱，在侧壁中央取两个孔，分别输入空气和氮气。再在两端及两侧壁取小孔，便于气体采样和平衡舱内压力。实验过程中采用生石灰和硅胶干燥剂吸收舱内CO2和水蒸气。每天10∶00～18∶00将B组、C组和D组大鼠放置于低氧舱内，关闭舱门，间歇性地向舱内充入压缩空气和氮气，30 s充入氮气，随后30 s充入压缩空气，以此60 s循环一次。采用测氧仪实时监测舱内氧浓度，调节气体流量，保证每次循环时舱内的最低氧浓度为4%～6%，之后逐步恢复至21%。如此持续30 d即成功复制大鼠OSAHS模型。中间随机取B组大鼠静脉血和心肌组织送检。C组大鼠取出低氧舱后正常饲养30 d，取静脉血和心肌组织送检。D组大鼠继续依照上述方法在低氧舱内处理30 d，随后抽取静脉血和心肌组织送检。

1.3 标本采集和处理

1.3.1 检测血清MDA含量和SOD活性 各组大鼠均抽取静脉血2 ml送检。所得静脉血在1 800 r/min下离心10 min后获取血清，按照试剂盒说明书检测MDA含量和SOD活性。SOD活性采用邻苯三酚自氧化法检测，MDA含量采用硫代巴比妥酸法检测。

1.3.2 检测心肌组织GSH活性 各组大鼠取心肌组织0.5 g送检。将心肌组织放入清水中洗净，滤纸吸干，称重后剪碎匀浆，以3 500 r/min低温离心15 min。取上清液用以检测GSH酶活性。按照试剂盒说明书采用比色法测定。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS17.0进行分析处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组样本间差异比较采用方差分析，组间两两比较采用F检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 行为变化

复制模型成功后观察大鼠的行为变化，大鼠在白天即表现出精神不佳，反应迟钝的情况，在夜间睡眠时打鼾（类似于喉鸣音）、呼吸暂停伴随胸腹式反常呼吸运动。对照组大鼠未出现上述情况。

2.2 血清M D A含量及SO D活性

4组大鼠血清MDA含量和SOD活性见表1。结果表明，与A组大鼠比较，B组大鼠MDA含量增高，SOD含量降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；C组大鼠MDA和SOD含量恢复正常，差异无统计学意义（P＞0.05）；D组大鼠MDA含量增高，SOD含量降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3 心肌组织G SH活性

4组大鼠的心肌组织GSH活性见表2。结果表明，与A组大鼠比较，B组大鼠心肌组织GSH活性降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；C组大鼠心肌组织GSH活性恢复正常，差异具有统计学意义（P＞0.05）；D组大鼠心肌组织GSH活性降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 4组大鼠血清M D A和SO D值比较 （n=10，±s）

表1 4组大鼠血清M D A和SO D值比较 （n=10，±s）

组别P值A组 3.09±0.51 443.08±32.19 B 组 3.91±0.61 3.261 0.004 381.51±28.74 4.512 0.000 MDA/（μmol/g）F值P值SOD/（IU/g）F值C组D组3.21±0.54 4.52±0.87 0.511 4.484 0.615 0.000 438.11±31.52 337.56±31.32 0.349 7.430 0.731 0.000 F值 8.256 12.291 P值 0.000 0.000

表2 4组大鼠心肌G SH水平比较 （n=10，±s）

表2 4组大鼠心肌G SH水平比较 （n=10，±s）

组别F值50.21±9.32 40.37±6.12 2.791 C组P值A组B组0.012 GSH/（μmol/g）48.75±8.62 0.364 D组 32.78±5.98 4.978 0.000 F值 8.115 P值 0.000 0.720

3 讨论

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征具有高发病率的特点，严重危害人体多个系统，已成为近年来的研究热点。国外发病率约为2%～4%，国内发病率约为3.5%～4.8%，其中，中老年人群中患病率随年龄的增加而增高。OSAHS的病理学特征为睡眠高阻力性呼吸。睡眠时胸腔负压增大，咽部扩张肌收缩活动减弱，进一步加重上气道解剖狭窄，直至完全闭合。目前，针对OSAHS研究的常用复制模型方法包括单纯间歇性改变氧浓度、偶发缺氧、低压低氧诱导、限制通气、上气道机械压力性震动、气管阻塞、睡眠剥夺等。OSAHS动物模型尚无公认的评价标准，主要观察动物模型和人类OSAHS疾病的特征是否符合，指标包括[7]：①症状：鼻鼾、睡眠紊乱、呼吸暂停等；②咽部解剖结构：咽腔径线、咽壁软组织、咽部肌肉电生理情况；③多导睡眠图（Polysomnography，PSG）：动物呼吸紊乱指数和睡眠分期。目前认为，检测PSG是OSAHS诊断的“金标准”：每晚7 h睡眠中反复发作呼吸暂停和低通气30次以上，或睡眠呼吸暂停低通气指数（AHI）≥5次/h即可确诊。

OSAHS患者引发心血管疾病的主要病理过程是缺氧、高碳酸血症等因素持续存在，导致交感神经兴奋异常增强，其中，呼吸气流停止反复发作引起的IH是最核心原因。缺血/低氧阶段，细胞自我调节以适应低氧环境；再灌注/复氧阶段，细胞内氧气含量急剧增加，该现象称之为缺氧/再氧合（hypoxia/reoxygenation），导致ROS生成，促进氧化应激发生。OSAHS患者的严重程度与氧化应激的发生密切相关[8]。氧化应激是指机体在受到有害刺激时，体内的高活性分子过度生成，氧化程度超出了氧化物的清除能力，氧化和抗氧化系统失衡，从而导致机体损伤[9-10]。氧化应激可由若干标志物的含量来反应，主要包括脂质过氧化物，氧化蛋白，如MDA、SOD、GSH等。

本研究发现，OSAHS复制模型成功后，大鼠MDA含量增高，SOD活性降低，心肌组织GSH活性降低，表明反复的阻塞性呼吸暂停会导致氧化应激反应发生，使氧化和抗氧化作用失衡，从而引起一系列生理过程异常。大鼠在复氧后MDA含量、SOD活性和心肌组织GSH活性恢复正常，与对照组比较差异无统计学意义。持续缺氧大鼠MDA含量增高，SOD活性降低，心肌组织GSH活性降低，表明大鼠心肌功能已严重受损。究其原因可能是：持续性缺氧导致中性粒细胞结构改变，变形性降低，引起中性粒细胞在肺内聚集、激活，大量活性氧由此释放，从而严重损伤组织和细胞。

OSAHS患者在睡眠中由于反复上气道阻塞的发生，多数会出现间断的缺氧和复养过程，这类似于缺血过程中的再灌注过程中出现的病理性改变，产生过多的活性氧，从而引起机体的氧化应激状态的改变。本研究中成功复制了阻塞性睡眠呼吸暂停综合征大鼠模型，观察到了IH对大鼠心肌氧化应激的损伤及其复氧后的变化情况，对于阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的发病机制有了清晰的认识，可帮助找到治疗人类OSAHS患者的突破点，对于预防和治疗阻塞性睡眠呼吸暂停综合征有着一定的临床指导意义。

综上所述，OSAHS存在氧化应激，严重损伤心肌组织，缺氧时MDA含量、SOD和GSH活性改变，而复氧后恢复。血清MDA含量和SOD活性及心肌组织GSH活性可以反应氧化应激的严重程度。

参 考 文 献：

[1]WOLF J,NARKIEWICZ K.Obstructive Sleep Apnea[M].Special Issues in Hypertension,2012:121-131.

[2]BADR M S.CentralSleep Apnea[M].EssentialsofSleep Medicine,2012:219-232.

[3]MAKRIS D,NTALAPASCHA M,ZAKYNTHINOS E.The association between oxidative stress and obstructive sleep apnea syndrome[J].Sleep and Breathing,2012,16(1):1.

[4]宋凯英,徐平,史艳红.OSAS大鼠模型的实验研究[J].遵义医学院学报,2012,35(3):189-192.

[5]WANG W,HE J,LU X.Animal model of obstructive sleep apnea with New Zealand rabbit[J].Journal of Clinical Otorhino-Laryngology,Head,and Neck Surgery,2012,26(12):555.

[6]CROSSLAND R F,DURGAN D J,LLOYD E E,et al.A new rodent model for obstructive sleep apnea:effects on ATP-mediated dilations in cerebral arteries[J].American Journal of Physiology-Regulatory,Integrative and Comparative Physiology,2013,305(4):334-342.

[7]EPSTEIN L J.Clinical guidelines for the evaluation of adults with obstructive sleep apnea[J].Sleep Loss and Obesit,2012,59(7):191-202.

[8]平芬,李琪,韩书芝,等.氧化应激与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的相关性研究进展[J].河北医药,2012,34(20):3130-3132.

[9]董万里.阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征与氧化应激研究进展[J].中国综合临床,2013,29(6):670-672.

[10]邱昌明,李洁,李兵,等.慢性间隙性缺氧对大鼠心肌氧化应激影响[J].重庆医科大学学报,2012,37(3):209-211.

（张蕾 编辑）

Myocardial oxidative stress injury and changes after reoxygenation in rat model of obstructive sleep apnea syndrome

Pei-yan Tian1,Ying-kang Chen2,Fu-shan Xie1,Shun-mao Yang3
(1.Department of Physiology,2.Department of Pathology,Qiannan Medical College for Nationalities,Qiannan,Guizhou 558000,China;3.Department of Geriatrics,the Third Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Qiannan,Guizhou 558099,China)

ObjectiveTo establish obstructive sleep apnea syndrome(OSAHS)rat model by intermittent hypoxia(IH)and to observe the myocardial oxidative stress injury and changes after reoxygenation.MethodsIn this study,10 untreated rats were enrolled into control group(group A).Through 30-d IH,obstructive sleep apnea syndrome model was established in 30 rats.among which 10 rats had examination of venous blood and myocardial tissues just after model establishment(group B),10 rats had reoxygenation immediately after model establishment(group C)and their venous blood and myocardial tissues were examined after 30-d normal feeding,still 10 rats had IH for additional 30 days (group D)before examination of their venous blood and myocardial tissues.The content of serum malondialdehyde(MDA),the activity of serum superoxide dismutase(SOD),and the activity of glutathione(GSH)in myocardial tissue were detected and compared between the groups.ResultsCompared with the group A,the serum MDA content increased,the serum SOD activity and the activity of glutathione(GSH)in myocardial tissue decreased in the group B (P＜0.05);the indexes returned to normal in the group C (P＞0.05);however,in the group D,the myocardial GSH activity and the serum SOD activity were significantly decreased,and the serum MDA content was significantly increased(P＜0.05).ConclusionsOxidative stress appears in OSAHS,and causes severe injury ofmyocardial tissue.Hypoxia can change MDA content,and SOD and GSH activity which will recover after reoxygenation.Hence,serum MDA content and SOD and GSH activity can reflect the severity of oxidative stress in myocardial tissues.

obstructive sleep apnea syndrome;intermittent hypoxia;rat;myocardial oxidative stress injury

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.005

1005-8982（2017）13-0024-04

2016-11-30