岩鹿乳康胶囊对乳腺增生大鼠乳腺组织及雌孕激素受体表达的影响*

郭宇飞，吕娟，王书勤

（1.河南省中医院，河南 郑州 450002；2.河南中医药大学，河南 郑州 450046）

岩鹿乳康胶囊对乳腺增生大鼠乳腺组织及雌孕激素受体表达的影响*

郭宇飞1，吕娟2，王书勤2

（1.河南省中医院，河南 郑州 450002；2.河南中医药大学，河南 郑州 450046）

目的观察岩鹿乳康胶囊对乳腺增生大鼠乳腺组织及雌孕激素受体表达的影响，探讨其治疗乳腺增生的作用机制。方法用肌内注射外源性苯甲酸雌二醇及黄体酮的方法复制大鼠乳腺增生模型，观察各组大鼠乳腺组织变化，用免疫组织化学法检测雌激素受体亚型（ERα、ERβ）和孕激素受体（PR）的表达水平。结果岩鹿乳康胶囊能减少实验大鼠乳腺导管上皮细胞层数和腺泡数，同时降低乳腺组织ERα、PR的表达，提高ERβ的表达，抑制乳腺组织增生。结论岩鹿乳康胶囊对大鼠乳腺增生具有抑制作用，其治疗机制可能与上调ERβ，下调ERα、PR的表达有关。

岩鹿乳康胶囊；乳腺增生；雌激素受体亚型；孕激素受体

乳腺增生是妇女的一种常见病和多发病，以周期性乳房疼痛为主要特征的一种既非炎症又非肿瘤的乳腺疾病，是乳腺实质的良性增生，属中医学“乳癖”范畴。岩鹿乳康胶囊是彝医药，由岩陀、鹿衔草、鹿角霜三味药组成，具有益肾、活血，软坚散结之功效，在治疗乳腺增生上具有良好临床疗效。本研究通过复制乳腺增生大鼠模型，观察各组大鼠乳腺组织病理变化，测定乳腺组织中雌激素受体（estrogen receptor，ER） 亚型 （ERα、ERβ） 和孕激素受体（prosgestogen receptor，PR）水平，探索岩鹿乳康胶囊抑制乳腺增生的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年未孕Wistar雌性大鼠60只（北京维通利华有限公司提供），鼠龄7～8周，体重180～200 g，合格证号：11400700094092。

1.2 实验用药及试剂

岩鹿乳康胶囊（云南龙海天然植物药业有限公司，批号：z20025379），枸橼酸他莫西芬片（三苯氧胺，扬子江药业集团有限公司，批号：08062501），乳癖消颗粒（哈尔滨太华药业有限公司，批号：z19990028），苯甲酸雌二醇注射液（苏州苏牧动物药业有限公司，批号：100862511），黄体酮注射液（天津金耀药业有限公司，批号：h12020533）。SA1022兔IgG-免疫组织化学试剂盒SABC即用型，DAB显色试剂盒（批号：AR1022）均购自武汉博士德生物工程有限公司。ERα 抗体（批号：21244-1-AP），ERβ 抗体（批号：14007-1-AP）均购自美国Proteintech公司，PR抗体（批号：bs-0183R）购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分组、复制模型及给药 将Wistar雌性大鼠60只随机分为空白组、疾病模型组、去卵巢组、三苯氧胺组、乳癖消颗粒组和岩鹿乳康胶囊组，每组10只。除空白组外，其余各组大鼠大腿内侧肌内注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/（kg·d），使用25 d后改为肌内注射黄体酮4 mg/（kg·d），连续5 d，复制乳腺增生模型[1]。空白组、疾病模型组及去卵巢组蒸馏水灌胃0.2 ml/d，三苯氧胺组2.07 mg/（kg·d），乳癖消颗粒组2.52 g/（kg·d），岩鹿乳康胶囊组630 mg/（kg·d），各组分别灌胃给药4周，末次给药后24 h处死动物取材。

1.3.2 组织形态学观察 取大鼠第3对乳腺，用10%甲醛溶液固定、石蜡包理、连续切片、染色，光镜下计数导管上皮层数和腺泡数。

1.3.3 ERα、ERβ、PR免疫组织化学染色 采用免疫组织化学SABC法，按试剂盒说明书步骤进行，高倍镜下观察，拍片。用Image-Pro Plus 6分析软件对各组照片进行平均光密度测算，定量分析。细胞胞浆或细胞核呈黄色或棕黄色着色为阳性表达，平均光密度值[mean density=（IOD SUM）/area]反映了这张照片上免疫反应物的表达强度。ERα、ERβ、PR阳性表达的水平与平均光密度值呈正相关。

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件处理数据，用完全随机设计的单因素方法（one-way ANOVA），实验结果以均数±标准差（±s）表示，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠乳腺形态

空白组大鼠乳腺组织可见乳腺小叶体积小、形态规则，乳腺导管上皮细胞排列整齐，腺泡数量少，未发现有乳腺增生的症状（见图1～3）。与空白组比较，疾病模型组大鼠乳腺组织导管上皮细胞层数及腺泡数目增多（P＜0.05），腺泡和导管增生、扩张，细胞排列紊乱，有典型的乳腺增生症状。与疾病模型组比较，各治疗组（三苯氧胺组、乳癖消颗粒组及岩鹿乳康胶囊组）导管上皮细胞层数、腺泡数减少（P＜0.05），导管扩张减轻，乳腺增生程度均有不同程度的改善。去卵巢组导管上皮层数与腺泡数低于空白组，病理表现相近。见表1。

2.2 岩鹿乳康胶囊对乳腺增生大鼠乳腺组织ER α、ER β、PR 表达的影响

2.2.1 各组大鼠乳腺组织ERα的表达 与空白组比较，疾病模型组平均光密度值升高，阳性细胞表达增多（P＜0.05）。与疾病模型组比较，各治疗组平均光密度值降低（P＜0.05），阳性细胞表达减少。表明当大鼠乳腺组织形态表现为明显增生时，乳腺组织内的ERα表达水平随之升高，而各治疗组均可下调ERα表达，有益于抑制增生。岩鹿乳康胶囊组与三苯氧胺组比较差异无统计学意义，在数值上接近三苯氧胺组。见图1、表2。

2.2.2 各组大鼠乳腺组织ERβ的表达 与空白组比较，疾病模型组、去卵巢组的平均光密度值下降，阳性细胞表达减少。与疾病模型组比较，三苯氧胺组、岩鹿乳康胶囊组及乳癖消颗粒组的平均光密度值均升高，阳性细胞表达增多，且岩鹿乳康胶囊组及乳癖消颗粒组与疾病模型组比较有统计学意义（P＜0.05），表明岩鹿乳康胶囊组及乳癖消颗粒组可上调ERβ表达，以岩鹿乳康胶囊组最为明显。见图2、表2。

2.2.3 各组大鼠乳腺组织PR的表达 与空白组比较，疾病模型组平均光密度值升高，阳性细胞表达增多（P＜0.05）。与疾病模型组比较，去卵巢组、三苯氧胺组、岩鹿乳康胶囊组及乳癖消颗粒组平均光密度降低（P＜0.05），阳性细胞表达减少，表明乳腺增生模型大鼠的PR表达水平升高，三苯氧胺组、岩鹿乳康胶囊组及乳癖消颗粒组药物的应用能降低大鼠乳腺组织PR含量。见图3、表2。

图1 ER α免疫组织化学染色结果 （10×40）

图2 ER β免疫组织化学染色结果 （10×40）

图3 PR免疫组织化学染色结果 （10×40）

实验结果表明，疾病模型组大鼠乳腺组织明显增生时，乳腺内ERα和PR表达水平随之升高，ERβ表达下降。空白组的正常乳腺组织中ERα的表达率低于ERβ的表达。推测ERβ对正常乳腺有保护作用。去卵巢组的ERα、ERβ、PR的表达均低于空白组，这可能与大鼠去卵巢后内源性雌孕激素的缺乏导致雌孕激素受体的表达减弱有关。三苯氧胺组在ERα，PR表达上与疾病模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但在ERβ表达上与疾病模型组比较差异无统计学意义，提示ERα和ERβ对抗雌激素物质三苯氧胺来说，有不同的亲和力。ERα在多种细胞中可介导三苯氧胺的激动作用而ERβ则不能[2]。岩鹿乳康胶囊组在调节ERα，PR表达方面趋向三苯氧胺组，优于乳癖消颗粒组，在上调ERβ表达上优于这两组。

表1 各组大鼠乳腺导管上皮层数、腺泡数比较（n=6，±s）

表1 各组大鼠乳腺导管上皮层数、腺泡数比较（n=6，±s）

注：1）与疾病模型组比较，P ＜0.05；2）与空白组比较，P ＜0.05；3）与三苯氧胺组比较，P＜0.05

组别腺泡数空白组 2.167±0.7531） 3.667±1.0331）疾病模型组 4.667±1.2112）3） 13.333±2.1602）3）去卵巢组 1.833±0.7531） 2.833±0.7531）3）三苯氧胺组 2.667±0.8161） 4.667±1.0331）乳癖消颗粒组 3.333±1.0331）2） 7.667±1.6331）2）3）岩鹿乳康胶囊组 3.167±0.7531） 5.500±1.0491）2）导管上皮细胞层数

表2 各组大鼠乳腺组织ER α、ER β、PR平均光密度值比较 （n=10，±s）

表2 各组大鼠乳腺组织ER α、ER β、PR平均光密度值比较 （n=10，±s）

注：1）与疾病模型组比较，P＜0.05；2）与三苯氧胺组比较，P＜0.05；3）与空白组比较，P ＜0.05

组别PR空白组 0.309±0.0371）2）ERβ 0.382±0.0861）2） 0.475±0.084疾病模型组 0.704±0.0852）3）ERα 1.403±0.1433） 0.419±0.098去卵巢组 0.280±0.0691）2）3）0.366±0.0622）3） 0.256±0.0451）2）三苯氧胺组 0.406±0.0621） 0.443±0.054 0.379±0.0571）3）乳癖消颗粒组 0.486±0.1191）2） 0.491±0.0441） 0.501±0.0421）2）3）岩鹿乳康胶囊组 0.438±0.0751） 0.524±0.0671）2） 0.408±0.0541）3）

3 讨论

乳房是多种内分泌激素的靶器官，乳腺增生的病因除了过高的E2直接刺激或P值降低不能保护乳腺组织，使乳腺实质增生过度和复旧不全外[3]，还与局部乳腺组织ER、PR含量相关，ER、PR的表达量可提示乳房组织对性激素的敏感性。目前国内外的研究认为ER的功能主要是在ER信号通路中起重要作用，具体表现在激素相关的靶器官如乳腺组织、骨骼组织和脂肪组织[4]。ER是一类由配体激活的转录因子，是核受体超家族的成员，2种亚型ERα、ERβ介导雌激素而使其产生作用。ERα和ERβ在雌激素的靶组织分布不同调节机制也不同，两者有不同的生物学作用[5]，且在人类的乳腺中ERβ比ERα的分布更为广泛[6]。研究者[7]证实几乎100%的导管上皮不典型增生都高表达ERα，约75%的导管原位癌、大于90%的小叶原位癌，约70%的浸润性乳腺癌病灶中可检测到增高的ERα。约85%的正常乳腺导管上皮中有表达ERβ，其表达强度在正常导管上皮、导管位癌、浸润性导管癌依次减少。有研究[8]显示ERα与ERβ在45例正常乳腺组织中均有表达，且在表达量上，ERβ高于ERα，提示ERβ可能是正常乳腺的优势雌激素受体，ERβ的表达可能在正常乳腺细胞中发挥更重要的作用。KOEHLER等[9]在动物实验中发现ERβ对正常乳腺具保护作用。在正常乳腺中ERβ表达比ERα更为丰富，活化的ERα促进乳腺及其他组织细胞的增殖，己被推荐作为区分激素依赖和非激素依赖的乳腺癌的标志物；近期研究也表明活化的ERβ可拮抗乳腺及其他组织的增殖，高浓度的ERβ可以下调ERα的表达[10]。雌激素也能调节和控制PR的表达，PR依赖于ER存在并受雌激素的调节和控制，因而PR表达状态能够显示雌激素调节系统的功能状况。当孕酮含量升高时经PR的介导，通过完整的PR系统，使PR合成进一步增加，对PR的依赖敏感性同步增加，引起乳腺上皮细胞的增生和细胞功能活跃[11]。ER和PR过度表达与乳腺增生病的发生有较大相关性。

祖国医学称乳腺增生为“乳癖”，多因情志内伤，肝气郁结，乳络阻滞或肾阳不足以致冲任不调，气滞痰凝所致。治法则以疏肝理气，温补肾阳，活血化瘀，软坚散结，消肿止痛等为主。岩鹿乳康胶囊是彝医药，由岩陀、鹿衔草和鹿角霜三味药组成，岩陀，苦、涩，凉，有活血化瘀、理气祛痰、消肿止痛之功；鹿衔草味甘苦，性温，能补虚，益肾，活血调经，调理冲任；鹿角霜味咸，归肝肾经，能温阳寒，软坚散结。现代药理证明，岩陀主要化学成分为岩白菜素，具有抗炎、抗HIV、抑制微生物、镇咳、抗氧化、镇痛、增强免疫等作用[12]。鹿角霜能对抗戊酸雌二醇性小鼠乳腺增生，大剂量能抑制MA-737小鼠乳腺癌的生长[13]，且有类似内分泌激素的作用[14]。已经有相关研究证明鹿衔草通过植物雌激素样作用，提升血清雌激素水平[15]。因为结构上的相似性，植物性雌激素可通过ER的结合，从而表现出雌激素活性和抗雌激素活性2种重要的生物学活性[16]，由此可见，岩鹿乳康胶囊治疗乳腺增生与其改善机体内分泌功能有关，可能是通过调节激素分泌水平，减弱异常的雌、孕激素对乳腺的生物学效应。

综上所述，①岩鹿乳康胶囊组治疗大鼠乳腺增生，在对乳腺导管上皮层数和腺泡数等抑制作用方面优于乳癖消颗粒组，接近三苯氧胺组的抑制效果。②疾病模型组ERα和PR表达水平升高，ERβ表达下降。岩鹿乳康胶囊组可上调ERβ，下调ERα和PR的表达，提示岩鹿乳康胶囊治疗乳腺增生的机制可能与调节了ERα、ERβ、PR的表达相关，且ERβ的表达与乳腺保护作用密切相关。③三苯氧胺可下调ERα和PR的表达，对ERβ上调不明显，提示岩鹿乳康胶囊治疗乳腺增生的机制与雌激素受体拮抗剂三苯氧胺存在差异。岩鹿乳康胶囊组在抑制大鼠乳腺组织增生的同时，乳腺ERα，PR表达水平随之降低，同时ERβ表达上调。因而推测岩鹿乳康胶囊一方面下调大鼠乳腺组织ERα和PR的表达，使乳腺组织对雌激素的敏感性下降，从而减少受体与激素结合形成的复合物对基因的活化和对靶细胞的调节作用，起到抑制乳腺增生的作用，另一方面上调ERβ表达，对乳腺组织起到保护作用。岩鹿乳康胶囊抑制与保护兼具，且能调理体质，体现了中医药在治疗乳腺增生的优越性。但其具体作用机制及是否有预防乳腺癌的作用，有待于今后进一步研究阐明。

[1]向骏马,张蓉,邢茂,等.中药治疗乳腺增生动物模型评价指标的研究进展[J].中国药房,2015,4:550-552.

[2]李宏,张文昌.雌激素受体α与β的比较 [J].福律医科大学学报,2005,增刊:5-7.

[3]吴在德.外科学[M].北京:人民卫生出版社,2008:307.

[4]PAPP B,PLATH K.Pluripotency re-centered around Esrrb[J].EMBO J,2012,22(31):4255-4257.

[5]柯江维,段荣.雌激素受体α(ERα)与β(ERβ)表达的研究和检测技术新进展及其在疾病预后判断中的应用 [J].实验与检验医学,2009,3(27):291-294.

[6]MEHTA R G,HAWEHOME M,METHA R R,et al.Differential roles of ERa and ERβin normal and neoplastic development in the mouse mammary gland[J].PLoS One,2014,9(11):e13175.

[7]朱信信,杨红鹰.雌激素受体亚型α和β在乳腺癌中的表达及临床意义[J].中国肿瘤临床与康复,2014,6:766-768.

[8]胡凤娣,邹天宁,邓明佳,等.雌激素受体亚型α、β在乳腺癌中的表达及其临床意义[J].实用癌症杂志,2013,2:130-132.

[9]KOEHLER K F,HELGUERO L A,HALDOSEN L A,etalReflections on the discovery and significance of estrogen receptor beta[J].Endocr Rev 2005,26(3):465-478.

[10]SPEIRS V,SKLIRIS G P,BURDALL S E,et al.Distinct expression patterns of ER alpha and ER beta in normal human mammary gland[J].J Clin Pathol,2002,55(5):371-374.

[11]柏青杨,王显艳,胡南,等.ER、PR在乳腺增生病中的定量表达及其临床意义[J].医学研究杂志,2007,7:112-113.

[12]刘斌,谭成玉,池晓会,等.岩白菜素的研究进展[J].西北药学杂志,2015,5:660-662.

[13]李增战,陈捷,苗文红,等.鹿仙散结汤治疗晚期乳腺癌30例[J].陕西中医,2007,5:526-527.

[14]徐国兵,王峥涛.鹿角对大鼠乳腺增生模型的治疗作用[J].中国药科大学学报,2006,4:349-352.

[15]林丽琼.鹿衔草对去卵巢大鼠钙调节激素的影响[D].福州:福建中医药大学,2012.

[16]宋丽华.植物性雌激素的研究进展[J].国外医学(药学分册),2003,1:25-29.

（张蕾 编辑）

Effect of Yanlurukang Capsules on breast tissue and expressions of ER and PR in rats with hyperplasia of mammary glands*

Yu-fei Guo1,Juan Lyu2,Shu-qin Wang2
(1.Henan Province Hospital of TCM,Zhengzhou,Henan 450002;2.Henan University of Chinese Medicine,Zhengzhou Henan 450046)

ObjectiveTo observe the effect of Yanlurukang Capsules on the breast tissue and expressions of estrogen receptor(ER)and progesterone receptor(PR)in rats with hyperplasia of mammary glands(HMG),and to discuss the mechanism.MethodsBreast hyperplasia rat model was established by intramuscular injection of estradiol benzoate and progesterone.The changes of breast tissue were observed in rats of each group.The expressions of ERα,ERβand PR in breast tissues were detected using immunohistochemical staining.ResultsYanlurukang Capsules significantly reduced the layers of mammary ductal epithelial cells and the number of acini in the experimental rats,down-regulated the expressions of ERα and PR,and enhanced the expression of ERβ.ConclusionsYanlurukang Capsules can inhibit HMG in rats,the mechanism may be related to up-regulation of ERβ expression and down-regulation of ERα and PR expressions.

Yanlurukang Capsules;hyperplasia of mammary glands;ER;PR

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.003

1005-8982（2017）13-0014-05

2016-12-21

河南省中医药科学研究专项课题普通项目（No：2013ZY02036）；河南省教育厅科学技术研究重点项目（No：13A360610）