He-Ne激光结合丹参对类风湿关节炎模型大鼠治疗的研究

郝金奇，计晶晶，陆改玲，余艳琴，陈 霞

(内蒙古科技大学包头医学院医学技术学院，内蒙古包头 014060)

He-Ne激光结合丹参对类风湿关节炎模型大鼠治疗的研究

郝金奇，计晶晶，陆改玲，余艳琴，陈 霞*

(内蒙古科技大学包头医学院医学技术学院，内蒙古包头 014060)

研究He-Ne激光结合丹参对类风湿关节炎大鼠的治疗效果，以期为临床风湿病治疗提供参考依据。将40只健康雄性Wistar大鼠随机分为5组，分别是A空白对照组、B模型组、C激光治疗组、D丹参治疗组和E丹参结合激光治疗组。除A空白对照组外，通过对其余各组大鼠注射鸡Ⅱ型胶原诱导后，成功建立了大鼠类风湿关节炎模型，分别给予对应的治疗，并分析各处理组大鼠大体情况、关节的肿胀度、评分及足踝关节X光片。研究表明：①与对照组相比，各处理组的大鼠类风湿关节炎评分、脚掌厚度均不同程度升高且有显著差异，其中模型组的最高，丹参结合激光治疗组最低，其余两组均降低且无显著差异；②X片显示：模型组大鼠关节出现了严重的骨质吸收、溶解、关节面融合，关节间隙变窄，关节基本损毁；丹参结合激光组可显著保留关节结构并使其免受侵蚀，而其余两组效果比丹参结合激光组稍弱一些。③与对照组相比，各处理组类风湿因子、血管内皮细胞生长因子及肿瘤坏死因子均升高，且有显著差异；与模型组相比，各药物组大鼠类风湿因子、血管内皮细胞生长因子及肿瘤坏死因子均有所降低，且均具有显著差异(P<0.05)，其中下降最明显的是He-Ne激光结合丹参治疗组。表明He-Ne激光结合丹参，能有效控制和改善类风湿关节炎大鼠的病情发展，具有良好的治疗效果。

丹参；He-Ne激光穴位照射；类风湿关节炎；治疗效果;大鼠

类风湿关节炎(Rheumatoid arthrtis，RA)是一种慢性、以关节滑膜慢性炎症病变为主的系统性、异质性疾病。在风湿病中危害最大且最难治愈[1-3]。目前治疗风湿病的常用西药有免疫抑制剂、非甾抗炎药、激素等[4]，对胃、肝、肾损伤很大，且不能治本。而常用中药如雷公藤，青风藤也有副作用[5-7]。因此，寻找安全、高效的创新疗法成为该领域研究的热点。风湿病属中医“痹症”，正如清代王清任的《医林改错》中所说“痹证有瘀血”。明朝李中梓《医宗必读卷十·痹》书中提到“治风先治血，血行风自灭”，因为丹参具有抑制血小板黏附、凉血消痈、活血生经、降低血黏度、消肿止痛、祛瘀生新、改善微循环等独特的药理功效，所以应该成为治痹之要药。激光对组织有生物效应，同时具有增强新陈代谢、消除肿胀、炎症、镇痛、改善血液流变学和微循环，调节机体免疫功能[8-12]等功能，在治疗风湿病方面也有报道[13-17]。可见，激光结合丹参在风湿病治疗中前景广阔。本文通过对健康大鼠注射鸡Ⅱ型胶原诱导后，成功建立了大鼠类风湿关节炎的模型，并在此模型基础上观察、评价He-Ne激光结合丹参对类风湿关节炎大鼠的治疗效果，以期为临床风湿病的治疗提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级健康雄性Wistar大鼠40只，内蒙古大学动物中心提供，编号为Scxk(蒙)2016-0001，8周龄～10周龄，体重180 g～200 g。所有大鼠饲养环境条件均一，温度25℃，自然光照，环境清洁，标准颗粒鼠粮喂养，水分充足，随机分笼，自由活动，适应性喂养1周后，进行试验，所有Wistar大鼠试验的方法、检测均得到伦理委员会的认可。随机分为A空白对照组、 B模型组、C激光治疗组、D丹参治疗组、E丹参结合激光治疗组。

1.1.2 主要试剂和设备 注射用青霉素钠、丹参注射液、生理盐水和戊巴比妥钠粉剂，哈药集团制药总厂产品；冰醋酸，台山市新宁制药有限公司产品；100 g/L多聚甲醛，天津市天大化工实验厂产品；完全弗氏佐剂(CFA)、鸡Ⅱ型胶原(CⅡ)、大鼠类风湿因子、大鼠血管内皮细胞生长因子、α肿瘤坏死因子试剂盒，美国Sigma公司产品； FSH-2型高速匀浆机，江苏省环宇科学仪器厂产品；D7000型尼康单反相机，日本尼康公司产品；测量精度为0.02 mm的不锈钢游标卡尺，上海力衡仪器仪表有限公司产品；X线拍片机；HJ-1B型氦氖激光照射仪，南京激光仪器厂产品。

1.2 方法

1.2.1 动物试验 所有大鼠都通过腹腔注射10 g/L的戊巴比妥钠溶液进行麻醉，按照40 mg/kg体重。将冰醋酸0.05 mL加入到100 mL去离子水中，形成混合溶液a；取一定体积的a溶液加入一定质量的鸡Ⅱ型胶原得到2 mg/mL的混合溶液b；取一定体积的b溶液再加入相同体积的完全弗氏佐剂在冰浴条件下用高速匀浆机充分混合，制成混合乳剂c，于4℃冰箱中保存备用。于每只大鼠皮肤、脚掌、尾部，5点皮内注射混合乳剂c(0.3 mL)进行类风湿关节炎造模，并用双氧水、无菌生理盐水冲洗注射针口处，再用碘伏消毒，空白对照组腹腔注射生理盐水。每只大鼠腹腔每日注射1次青霉素钠(每只每次30万单位)预防感染，连续注射3 d。在试验第7天进行第2次类风湿关节炎造模，操作同上。

1.2.2 试验分组及药物治疗方案 把40只雄性Wistar大鼠随机分为5组，每组8只。A空白对照组：腹腔注射生理盐水来代替造模的诱导乳剂，不给予治疗。B模型组：造模成功后，不给予治疗；C激光治疗组：造模成功后，采用He-Ne激光隔日足三里穴位照射1次，照射时间为30 min；D丹参治疗组：造模成功后，给予0.8 mg/kg丹参腹腔注射治疗，隔天1次；E丹参结合激光治疗组：造模成功后，给予0.8 mg/kg丹参腹腔注射治疗，隔天1次，并且采用He-Ne激光隔日足三里穴位照射1次，照射时间为30 min。

1.2.3 He-Ne激光穴位照射 采用He-Ne激光(波长是632.8 nm)隔日进行穴位照射，光斑直径约4 mm，输出功率为1.2 mW～1.5 mW，用大鼠固定器固定大鼠，每次照射足三里30 min。足三里在膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm处[18-19]。

1.2.4 后足评分方法 观察并记录各组大鼠的后足情况并量化评分(根据大鼠类风湿关节炎评分标准)。先算出每只大鼠后足评分的平均值，再算出每组大鼠后足评分的平均值(根据每只大鼠的评分)，并在第7、14、21、28、35天各记录1次，一直到试验结束。

1.2.5 脚掌厚度测量方法 记录并观察各组大鼠后足软组织的肿胀情况，并用游标卡尺测量大鼠的脚掌厚度(两后足)，用大鼠足部软组织相对最薄处代表脚掌厚度；后求出每只大鼠脚掌厚度的平均值，再算出每组大鼠脚掌厚度的平均值(根据每只大鼠脚掌厚度的平均值)，并在第7、14、21、28、35天各记录1次，一直到试验结束。

1.2.6 Elase法检测细胞因子的表达 于试验第35日，处死各组大鼠取血，每只大鼠从腹主动脉取全血5 mL，将血液放入离心管内，待血液凝固，放入高速离心机，3 000r/min高速离心10 min取样，用移液枪吸取上层血清，吸取血清至新离心管内的标本随即封冻于-80℃冰柜中待检。严格按照说明书操作，检测各组大鼠血清中类风湿因子、血管内皮细胞生长因子及肿瘤坏死因子的含量水平。

1.2.7 评分标准 大鼠的类风湿关节炎评分标准：0分,后足无关节炎表现；1分,后足1个～2个关节发红，软组织肿胀；2分，后足3个～4个关节发红，软组织肿胀；3分，后足5个或多于5个关节发红，软组织肿胀；4分，后足严重关节炎。

2 结果

2.1 不同处理组大鼠外观形态

对各组大鼠的后足、踝关节进行观察，观察皮肤色泽、后足行动、感染状况、踝关节肿胀情况，进行描述说明并拍照(图1)。A空白组大鼠脚掌正常，无红肿等；B模型组大鼠的脚掌普遍皮肤发红、皮肤的温度较高、关节强直、明显软组织肿胀、不能负重，少数大鼠的足部出现溃疡和红斑，行动能力明显受限；C激光治疗组、D丹参治疗组和E丹参结合激光组大鼠较B模型组大鼠整体有所改善，但仍然出现后足皮肤发红、皮肤温度高、行动能力受限、关节红肿等症状；E丹参结合激光组较模型组和其他治疗组大鼠症状明显好转，行动自如。

2.2 不同处理组大鼠类风湿关节炎评分、脚掌厚度

2.2.1 不同处理组大鼠类风湿关节炎评分 结果证实，A空白对照组的后足形态完全正常，评分记为0分；B模型组大鼠的脚掌关节发红、软组织肿胀严重，且在类风湿关节炎造模之后的第14天左右肿胀程度最大，随着时间的延长肿胀程度稍有降低，到试验结束时本组大鼠的脚掌评分在各组中最高；而各治疗组的大鼠与空白组大鼠相比，类风湿关节炎评分均降低，且具有显著差异(P<0.05)；与模型组大鼠相比，各治疗组大鼠的脚掌评分均降低，且都具有显著差异(P<0.05)。其中下降最明显的是E丹参结合激光治疗组且具有显著差异(P<0.05)(表1)。

A.空白对照组;B.模型组;C.激光治疗组;D.丹参治疗组;E.丹参结合激光组

A.Blank control group;B.Model group;C.Laser group;D.Salviamiltiorrhizagroup;E.Laser combined withSalviamiltiorrhizagroup

图1不同处理组大鼠后足外观形态

Fig.1 Hindfeet morphology of rats in different treatment groups

表1 不同处理组评分变化情况分析

2.2.2 不同处理组大鼠的脚掌厚度 结果显示，与空白对照组大鼠相比，各处理组大鼠的脚掌厚度呈明显持续上升状态，且有显著差异(P<0.05)，其中模型组大鼠双后足掌厚度最严重的程度；与模型组相比，各治疗组大鼠的脚掌厚度均降低且具有显著差异(P<0.05)；其中E丹参结合激光治疗组下降最明显，且具有显著差异(P<0.05)(表2)。

2.3 不同处理组大鼠后足踝关节X光片

在试验第35天处死所有大鼠进行取材，手术方法是取下各组大鼠的整体胫骨下段以及足部，并且立即标注每一个标本。同时取后足踝关节进行X光片的拍摄，观察各组大鼠的后足软组织肿胀程度、关节面结构和间隙的清晰程度以及关节的破坏程度(图2)。X片示结果显示，各组大鼠的掌指关节有明显差异，其中A空白对照组关节面光滑，上下关节面结构清晰，关节完整，骨质未出现破坏现象，关节间隙正常，软组织无肿胀；B模型组出现软组织肿胀，关节面融合，关节间隙变窄及消失，结构不清晰，出现了严重的骨质吸收、溶解现象，关节已经基本损毁；C激光治疗组和D丹参治疗组大鼠出现了关节结构的破坏，骨质吸收、溶解，但损坏程度较B模型组有所降低，未出现明显的软组织肿胀表现；E丹参结合激光组无软组织肿胀的表现，可显著地保留关节的结构。可见通过丹参结合激光治疗可使关节免受侵蚀。

表2 不同处理组脚掌厚度变化情况分析

A.空白对照组;B.模型组;C.激光治疗组;D.丹参治疗组;E.丹参结合激光组

A.Blank control group;B.Model group;C.Laser group;D.Salviamiltiorrhizagroup;E.Laser combined withSalviamiltiorrhizagroup

图2大鼠后足踝关节X线片结果

Fig.2 Rat ankle joint X-ray results

2.4 不同处理组大鼠类风湿因子、血管内皮细胞生长因子及肿瘤坏死因子的比较

与对照组相比，各处理组大鼠类风湿因子(rheumatoid factor,RF)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)增高，且有显著差异(P<0.05)；其中模型组上升最明显，与模型组大鼠相比，各治疗组大鼠的RF、VEGF及TNF-α增高均有所降低，且都具有显著差异(P<0.05)；其中下降最明显的是E丹参结合激光治疗组且具有显著差异(P<0.05)(表3)。

表3 不同治疗组大鼠类风湿因子、血管内皮细胞生长因子及肿瘤坏死因子比较

3 讨论

3.1 不同处理组大鼠外观形态分析

本研究通过对健康大鼠注射鸡Ⅱ型胶原诱导后，除空白对照组大鼠脚掌正常，其他大鼠的外观形态有显著的变化。模型组大鼠普遍脚掌皮肤发红、温度高，出现了明显的软组织肿胀且伴有关节强直、不能负重的症状，而且少数大鼠足部出现了溃疡和红斑，行动受限。以上结果说明成功建立了大鼠类风湿关节炎的模型。激光治疗组和丹参治疗组的大鼠较模型组的大鼠整体有所改善，分析可能原因是激光对组织有生物效应，激光直接照射或间接照射具有增强新陈代谢、消炎止痛、消除肿胀、还可以支配疼痛部位的交感神经节引起血流增加，促进致痛物质代谢，进而能够缓解疼痛；而丹参具有抑制血小板黏附、聚集和释放的作用，丹参可以改善类风湿关节炎造成的关节伤害，因而可促使类风湿关节炎的恢复[20]。而丹参结合激光治疗组大鼠皮温明显降低，关节肿胀明显好转，行动自如，这与王静平[21]研究结果一致，表明丹参结合激光照射可以改善局部血液循环，抑制或降低炎症致痛作用。所以可见丹参药物治疗结合适当的激光照射治疗可以使大鼠的类风湿关节炎的症状得到显著的改善，是治疗风湿病安全有效的方法。

3.2 不同处理组大鼠类风湿关节炎评分、脚掌厚度

空白组大鼠后足外观形态完全正常，类风湿关节炎评分和脚掌厚度都是正常水平；各处理组大鼠类风湿关节炎评分和脚掌厚度呈持续的上升状态，其中模型组大鼠双后足类风湿关节炎评分、脚掌厚度最高；说明类风湿关节炎可以对大鼠关节造成一定程度的伤害。与模型组大鼠相比，C组、D组和E组大鼠的类风湿关节炎评分、脚掌厚度均有所降低，且都具有显著差异(P<0.05)；因为激光对组织有生物效应，同时具有增强新陈代谢、消除肿胀、消炎止痛、改善血液流变学和微循环等作用，被广泛应用于临床治疗中，在治疗风湿病方面也有报道[22]。埃默里大学的风湿病学家对一组类风湿关节炎病人进行激光治疗后，患者双手功能有明显改善。丹参具有凉血消痈、活血生经、消肿止痛、祛瘀生新等功能，现代医学研究表明，丹参还能降低血黏度、抑制血小板黏附、改善血液的微循环，可以减少氧自由基的产生，提高组织缺氧的耐受性，所以丹参能够促进类风湿关节炎恢复。其中下降最明显的是E丹参结合激光治疗组，与崔淑莲等[16]用激光治疗风湿痛结果一致，可见丹参结合激光可以显著缓解类风湿关节炎大鼠脚掌的肿胀程度，改善脚掌的评分。可见激光照射结合丹参药物治疗风湿病能有显著的疗效。

3.3 大鼠后足踝关节X线片检查分析

X片研究结果证实，模型组大鼠和空白对照组大鼠的掌指关节对比发现了明显的软组织肿胀，严重的骨质吸收、溶解现象，掌指关节已基本损毁；由X片表明B组大鼠出现了类风湿关节炎的典型表现，进一步说明造模成功。C组和D组大鼠通过治疗关节结构破坏程度和骨质吸收现象以及软组织肿胀表现均较B组有所降低；可见经激光、丹参单独治疗后可显著保留关节结构并使其免受侵蚀；因为激光具有增强新陈代谢、消除肿胀、消炎止痛、等作用；丹参具有凉血消痈、活血生经、消肿止痛、祛瘀生新等功能，可使类风湿关节炎得到改善。而E组的关节结构清晰未受侵蚀且只有轻微的软组织肿胀表现。说明通过丹参结合激光治疗可以降低Wistar大鼠的软骨及骨破坏程度与范围和关节的损毁程度，能够有效的抑制病变周围组织的纤维组织增生和炎症反应。表明了丹参结合激光照射治疗可以抑制大鼠类风湿关节的炎症发展，同时可以保护关节的结构。

3.4 大鼠类风湿因子、血管内皮细胞生长因子及肿瘤坏死因子的分析

目前类风湿关节炎(RA)临床诊断的主要依据是临床表现、X射线光片和血清指标的类风湿因子(RF)。但因为RF不仅只见于类风湿关节炎患者，在其他免疫性疾病患者的血清中RF也出现阳性表达，因此单独的RF阳性也不足以确诊为RA，而RA病情的高度易变性和病程的不可预知性要求诊断指标的敏感性和特异性更高。目前研究表明，类风湿因子(RF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和肿瘤坏死因子(TNF-α)均参与类风湿关节炎的发病过程，所以本试验对RF、VEGF及TNF-α进行分析。

RF是在类风湿关节炎患者的血清中发现，主要存在于患者的血清和关节液中，是类风湿关节炎临床诊断的标准。VEGF是具有高度生物活性的一种糖蛋白，上调的VEGF，通过其受体特异性作用于血管内皮的细胞，促进血管内皮增生，从而促进新生血管和血管翳的形成，而新生血管的生成是RA发生和发展的关键步骤，已有研究证实，血清VEGF与关节病变程度和关节受累的范围呈正相关，所以血清 VEGF水平可以作为判断类风湿关节炎病情和预后的重要指标。此外，VEGF还能明显提高血管的通透性，促进炎症的形成和发展，尤其对慢性炎症的形成具有重要意义。因此，降低异常升高的血清VEGF水平，可以有效抑制滑膜血管增生及滑膜炎的发展。TNF-α是一种重要的促炎细胞因子，能上调单核巨噬细胞MMP-9的表达与活化，加强炎症细胞的侵蚀力，促进RA关节破坏，在RA致病过程中起到了重要作用。所以抑制TNF-α等促炎细胞因子，是治疗风湿病的重要途径。研究表明，与A组相比B组大鼠类风湿关节因子、血管内皮细胞生长因子及TNF-α增高且有显著差异(P<0.05)；与B组大鼠相比，各治疗组大鼠类风湿关节炎因子、血管内皮细胞生长因子及TNF-α均有所降低，且均具有显著差异，其中下降最为明显的是E丹参结合激光治疗组且有显著差异。可见,激光穴位照射结合丹参能够降低类风湿关节炎模型组大鼠的类风湿因子(RF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的水平，而且疗效优于其他治疗组，对类风湿关节炎大鼠有较好的疗效。

综上所述，丹参结合激光穴位照射能够有效的减轻类风湿关节炎大鼠的外观形态，缓解炎症关节的肿胀程度，降低大鼠类风湿关节炎评分；同时从X片证实了丹参结合激光穴位照射治疗，可以保护关节免受侵蚀，消除软组织肿胀，具有显著治疗作用，还可以对各处理组大鼠的类风湿关节炎因子、血管内皮细胞生长因子、肿瘤坏死因子具有重要调节作用，说明丹参结合激光穴位照射对类风湿关节炎具有一定治疗作用，可以为临床治疗及用药提供科学依据。本试验尚有不足及疏漏，丹参结合激光的治疗机制有待进一步研究，并需更深层次的探讨。

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StudyonHe-NeLaserCombinedwithSalviamiltiorrhizainTreatmentofRheumatoidArthritisModelRats

HAO Jin-qi， JI Jing-jing，LU Gai-ling，YU Yan-qin，CHEN Xia

(DepartmentofMedicalTechnology,BaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014060,China)

To study theSalviamiltiorrhizacombined with laser in the treatment of rheumatoid arthritis rat model induced by chicken Ⅱ collagen,to provide the reference for the treatment of rheumatoid arthritis in clinic,forty healthy male Wistar rats were divided into five groups randomiy，A is blank control group，B is model group，C is He-Ne laser acupoint irradiation treatment group，D isSalviamiltiorrhizatreatment group,E is He-Ne laser combined withSalviamiltiorrhizatreatment group.Except the blank control group,the rats in the other groups were injected with the chicken Ⅱ collagen to induce rat rheumatoid arthritis model.The general situation,ankle swelling degree,X slices were measured and the scores of rats were judged.The results showed that:①The score of rat rheumatoid arthritis and measurement of foot sole thickness:comparing with the blank control group,the score and thickness of the feet in model group of rheumatoid arthritis rats were highest, but the theSalviamiltiorrhizacombined with laser were lowest,the anther two groups were declined but no statistically difference;②X slices hows:it was showed severe soft tissue swelling and bone absorption in model group.It was prevented erosion inSalviamiltiorrhizawith laser group,and which was weaker inSalviamiltiorrhizalow and high dose groups.③Compared with the blank group,the RF，VEGF and TNF-α in the rats of each drug group were all increased in medicine group and the difference was statistically significant.Compared with the model group,the increases of RF，VEGF and TNF-α in the rats of each drug group were all decreased and the difference was statistically significant，Among them,the most obvious decline was He-Ne laser combined withSalviamiltiorrhizatreatment group.Salviamiltiorrhizacombined with laser can effectively control the progress of rheumatoid arthritis in rats,and has the therapeutic effect.Keywords:Salviamiltiorrhiza；He-Ne laser acupoint irradiation；rheumatoid arthritis；treatment effect;rat

2017-01-17

包头市医药卫生科技计划项目(Wsjj2014014)

郝金奇(1980-)，男，山东菏泽人，讲师，硕士，主要从事流行病与卫生统计学研究。*

S854.54;S857.165

:A

:1007-5038(2017)09-0043-06