鸡源结肠弯曲菌耐药性分析

唐梦君，周 倩，张小燕，张 静，陈大伟，顾 荣，万 玉，杨星星，赵 敏，周 生，高玉时

(中国农业科学院家禽研究所/农业部禽类产品质量安全风险评估实验室(扬州)，江苏扬州 225125)

鸡源结肠弯曲菌耐药性分析

唐梦君，周 倩，张小燕，张 静，陈大伟，顾 荣，万 玉，杨星星，赵 敏，周 生，高玉时*

(中国农业科学院家禽研究所/农业部禽类产品质量安全风险评估实验室(扬州)，江苏扬州 225125)

为了解江苏省鸡源结肠弯曲菌的流行情况和药物敏感性，对江苏省不同规模化养鸡场、农贸市场和超市的鸡泄殖腔样品和鸡肉产品进行结肠弯曲菌的分离及PCR鉴定；采用纸片扩散法测定分离株对17种抗菌药物的敏感性。结果显示，从750份样品(禽肉产品和泄殖腔棉拭子)中分离到81株结肠弯曲菌，分离率为10.8%。耐药性试验结果显示，80%以上菌株对头孢曲松、妥布霉素、诺氟沙星、环丙沙星、林可霉素和甲氧苄氨嘧啶耐药，其中甲氧苄氨嘧啶耐药率达99%，对美罗培南和氟苯尼考保持高度敏感。所有测试菌株出现多重耐药，优势耐药谱为LIN/CRO/CN/T/NOR/CIP。调查结果为结肠弯曲菌防控提供参考依据。

鸡；结肠弯曲菌；耐药性；耐药谱

结肠弯曲菌(Campylobactercoli)是弯曲菌属的一种，是近十几年来受到国内外广泛关注的人畜共患病原菌，可引起人类肠炎和食物中毒，其主要症状为腹泻性肠炎[1]。结肠弯曲菌易定植于家禽肠道，感染后无明显症状，临床上不需要抗菌药物的治疗，但鸡群长期携带此菌，在预防和控制其他家禽疾病的过程中，大量抗菌药物的使用导致了弯曲菌耐药菌株的产生[2-3]。当人类感染了具有耐药性的弯曲菌时，将严重影响临床治疗的有效性。因此，以江苏省分离菌株为基础，了解结肠弯曲菌的污染情况，并掌握该菌对常用抗菌药物的耐药程度及不同菌株所表现出的耐药谱的差异，填补我国结肠弯曲菌流行病学资料，为我国耐药结肠弯曲菌的监测及有效防控提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源及菌株 采集江苏省徐州、宿迁和盐城等各市县不同规模化养鸡场、农贸市场和超市的鸡泄殖腔样品和鸡肉样共750份。泄殖腔棉拭子样品用灭菌棉签采集鸡泄殖腔，插入Carry-Blair运输培养基；鸡肉样品用经PBS浸泡过的灭菌棉球擦拭。质控菌株大肠埃希菌(Escherichiacoli)ATCC25922，扬州大学兽医学院惠赠。

1.1.2 引物 采用弯曲菌属的16 S rRNA基因以及结肠弯曲菌ceuE基因为靶基因。引物序列参照文献[4]。16 S rRNA基因，上游引物5′-ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC-3′，下游引物： 5′-GGACGGTAACTAGTTTAGTATT-3′；结肠弯曲菌ceuE基因，上游引物：5′-AATTGAAAAATTGCTCCAACTATG-3′，下游引物：5′-TGATTTTATTATTTGTAGCAGCG-3′，引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.1.3 培养基及试剂 Cary-Blair半固体培养基、CCDA培养基、含200 mL/L脱纤维绵羊血MH培养基、含200 mL/L甘油BHI培养基；PBS溶液；rTaqpremix；细菌DNA提取试剂盒；其他均为试验常规试剂。

1.1.4 抗菌药物 选取8大类17种畜禽养殖常用抗菌药物，包括β-内酰胺类有氨苄西林(AMP)、头孢曲松钠(CRO)、亚胺培南(IPM)、美罗培南(MEM)；氨基糖苷类有庆大霉素(CN)、阿米卡星(AK)、妥布霉素(TOB)；喹诺酮类有诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、氧氟沙星(LEV)；磺胺类有复方新诺明(SXT)、甲氧苄氨嘧啶(T)；大环内酯类有红霉素(E)、阿奇霉素(AZM)；四环素类有四环素(TE)；洁霉素类有林可霉素(LIN)；氯霉素类有氟苯尼考(FF)。以上抗菌药物为英国OXOID公司产品。

1.1.5 主要仪器 生物安全柜(A2)，日本ESCO公司产品；生化培养箱(HPS-150)，太仓市华美生化仪器厂产品；PCR仪，德国Eppendorf公司产品；电泳仪(DYY-12型)，北京市六一仪器厂产品；凝胶成像系统，GBOX基因有限公司产品；水浴锅(XMTD-204)，金坛市文化仪器有限公司产品；离心机(XT15R)，日本HITACHI公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离 从运送培养基中取出棉拭，置于含1 mL灭菌 PBS的指形管中，充分浸透，取100 μL浸出液经适当稀释后，取100 μL涂布CCDA平板；鸡肉样品取100 μL 灭菌棉球挤出的PBS液，经稀释后取100 μL涂布CCDA平板，微需氧条件42℃培养36 h。挑取CCDA平板上灰白色的可疑菌落，进行PCR鉴定。

1.2.2 二重PCR鉴定 经纯化后的结肠弯曲菌采用试剂盒提取细菌基因组DNA。采用二重PCR鉴定结肠弯曲菌，25 μL PCR反应体系：rTaqpremix 12.5 μL，上、下游引物两对(10 μmol/L)各1 μL，无菌去离子水9.5 μL，模板DNA 1 μL。PCR循环参数：95℃预变性1 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；再72℃延伸10min。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳成像。

1.2.3 药敏试验 采用WHO推荐的Kirby-Bauer法，根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)[5]标准方法进行。用无菌棉签从M-H平板上刮取纯化培养的细菌至500 μL PBS缓冲溶液，将菌液稀释至0.5麦氏浓度，取100 μL稀释后的菌液均匀涂布于M-H平板，根据药敏纸片说明书进行测试，42℃微需氧培养36 h～48 h后,用直尺测定抑菌圈直径(mm)。以抑菌圈直径大小判断耐药(resistant)、中敏(intermediate)和敏感(susceptible)。数据采用Excel2015整理分析。

2 结果

2.1 分离鉴定结果

结肠弯曲菌在CCDA平板上为灰白色湿润的菌落(图1)，挑取可疑菌落经PCR鉴定，能成功扩增出两条大小为857 bp和462 bp的目的片段(图2)。对采集的750份样品进行统计，得到结肠弯曲菌81株，分离率为10.8%。其中，泄殖腔样品600份，分离率为9.5%，分离到57株结肠弯曲菌；禽肉产品150份，分离率为16%，分离到24株结肠弯曲菌。

图1 细菌的菌落形态

2.2 耐药性分析

2.2.1 细菌对17种抗菌药物耐药情况 81株鸡源结肠弯曲菌分离菌株对17种抗菌药物存在不同程度的耐药，大多数菌株对氨苄西林、头孢曲松钠、庆大霉素、妥布霉素、诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、甲氧苄氨嘧啶、四环素和林可霉素耐药。对甲氧苄氨嘧啶耐药率最高，达99%，对美罗培南和氟苯尼考最为敏感，敏感率为98%和91%。对氨苄西林、阿奇霉素、四环素和氧氟沙星保持中度敏感(表1)。

M.DNA 标准DL 2 000;1～23.样品

M.DNA Marker DL 2 000;1-23.Samples

图2 PCR鉴定结果

Fig.2 PCR identification results

表1 81株鸡源结肠弯曲菌抗菌药物敏感性检测结果

2.2.2 分离菌株对17种抗菌药物的耐药谱分析 81株结肠弯曲菌对17种抗菌药物共产生12种耐药类型，30种耐药谱型。1株结肠弯曲菌对15种抗菌药物有不同程度耐药，存在明显多重耐药现象，所有菌株至少耐4种抗菌药物。耐9种抗菌药物的菌株数量最多有13株，占16.0%，优势耐药图谱为LIN/CRO/CN/T/NOR/CIP(表2)。

表2 鸡源结肠弯曲菌的耐药谱型

3 讨论

从江苏省采集的750份鸡泄殖腔和鸡肉样品中分离到81株结肠弯曲菌，分离率为10.8%。结肠弯曲菌分离株对头孢曲松、妥布霉素、诺氟沙星、环丙沙星、林可霉素、甲氧苄氨嘧啶耐药率较高，这与近年来我国大量使用喹诺酮类等抗菌药物治疗家禽腹泻等疾病有关[6]。这与王新等[7]的报道一致，但与韩新锋等[6]报道的四环素耐药率为91.67%差异较大，原因可能是不同地区在畜禽养殖过程中抗菌药物的选择和用量标准不同，从而导致耐药性差异。分离株对氟苯尼考保持高度敏感性，可考虑作为临床换用药物。已有研究表明，在弯曲菌感染中，结肠弯曲菌少于空肠弯曲菌，仅占5%[7]，但来自禽肉和其他动物肉的结肠弯曲菌多重耐药比空肠弯曲菌更为普遍[8-10]。17种抗菌药物的药敏检测结果表明，所有菌株耐4种抗菌药物以上的达100%，最多可耐15种抗菌药物，说明鸡源结肠弯曲菌多重耐药普遍，应该指导畜禽生产上抗菌药物的合理使用，最大程度上避免抗菌药物的滥用。同时，应该建立长期的弯曲菌耐药性监测，了解其变化趋势，为弯曲菌病的防控提供依据。

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AntimicrobialResistanceofCampylobactercoliIsolatedfromChickens

TANG Meng-jun,ZHOU Qian,ZHANG Xiao-yan,ZHANG Jing,CHEN Da-wei,GU Rong,WAN Yu,YANG Xing-xing,ZHAO Min,ZHOU Sheng,GAO Yu-shi

(PoultryInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,LaboratoryofQualityandSafetyRiskAssessmentforPoultryMinistryofAgriculture(Yangzhou),Yangzhou,Jiangsu,225125,China)

The aim of the research was to study the epidemiology and antimicrobial resistance ofCampylobactercoliisolated from chickens in Jiangsu province.81 strains were isolated and idetified by polymerase chain reaction from 750 samples which collected from chicken meat and cloacal swabs in different chicken farms,agricultural markets and supermarkets.81 isolates were examined for antimicrobial resistance by using K-B method.The results showed that more than 80% strains performed resistance to ceftriaxone,tobramycin,norfloxacin,ciprofloxacin,lincomycin and trimethoprim,the resistant rate of trimethoprim was 99%,all strains kept susceptible to meropenem and florfenicol.A total of 81 strains were multi-drug resistance,the advantage resistant profile was LIN/CRO/CN/T/NOR/CIP.The research provided evidence for surveillance of the antimicrobial resistance ofC.coli.

chicken;Campylobactercoli;antimicrobial resistance;resistant profile

2017-01-05

十三五国家重点研发计划高危金属中毒病防控技术研究项目(2016YFD0501208)；2017国家农产品质量安全风险评估重大专项项目(GJFP2017007); 扬州市社会发展项目(yz2016058);扬州市家禽质量安全科技服务平台建设项目(yz2015162)

唐梦君(1980-)，女,重庆人，博士，主要从事食源性病原菌检测及耐药性研究。*

S859.796

:A

:1007-5038(2017)09-0018-05