一株驯化啤酒酵母的分离鉴定及扩大培养条件的优化

徐进强，梁红雁，赵吴静，武中庸，陈 鑫，李昱辉,蒲万霞*

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州 730050；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070)

一株驯化啤酒酵母的分离鉴定及扩大培养条件的优化

徐进强1,2，梁红雁1,2，赵吴静1，武中庸1，陈 鑫1,2，李昱辉1,2,蒲万霞1*

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州 730050；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070)

为筛选一株驯化啤酒酵母,并对发酵罐扩大培养工艺进行优化，为今后大规模生产提供试验数据。于麦芽汁培养基分离挑选某株具有较好生长力的酵母菌，进行形态学、生化及分子生物学鉴定。应用正交试验设计，从摇瓶温度、pH、取样时间及发酵罐的转速、装液量、接种量等方面进行优化。结果表明，驯化酵母菌株形态学、生化鉴定证明该菌株属于酵母属；发酵罐扩大培养最佳工艺为：转速200 r/min，接种量50 mL/L，装液量4.5 L，此条件下酵母活菌含量为2.8×108CFU/mL。驯化前后表现一致，没有发生变异。优化啤酒酵母菌的发酵罐扩大培养工艺，为下一步规模化生产提供理论参考。

驯化酵母;生化鉴定；分子鉴定；发酵罐；扩大培养

啤酒酵母因其发酵性能良好、繁殖力强、性能稳定等特点而成为目前应用最广泛的单细胞真菌微生物之一[1]，人类利用酵母制作发酵产品的历史可以追溯到公元前3 000多年[2]。酵母发酵是指细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物，释放能量并产生各种不同代谢产物，以有机物为最终电子受体的生物氧化过程，是其获得能量的途径[3]。

目前，发酵一般分为摇瓶发酵和扩大培养发酵。实验室条件下，得到摇瓶优化条件后再进行发酵罐扩大培养[4]。但因发酵扩大培养过程较复杂，常存在“放大效应”，即在实验室摇瓶研究中得到的数据和规律，在放大过程中，随着发酵规模的扩大，因为发酵罐溶解氧、二氧化碳含量、剪切力等影响因素[5-6]，目标产物的产量不断下降，无法重复实验室的试验结果。因此，筛选一株高性能酵母及对发酵罐扩大培养工艺进行优化，对于提高工业生产效率具有重要意义。本试验旨在研究筛选一株驯化啤酒酵母及对发酵罐扩大培养工艺进行优化，以期为今后大规模生产提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 驯化酵母菌，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所天然兽药研发试验室保存,实验室保存原始酵母菌株。

1.1.2 主要试剂和仪器设备 培养基主要成分麦芽汁，购自甘肃兰州黄河啤酒厂；蛋白胨，杭州微生物试剂有限公司产品。

微量生化鉴定管，电子比浊仪Densi CHEK Plus，恒温振荡培养箱，PCR仪，电泳槽，微生物发酵罐。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分离与鉴定

1.2.1.1 酵母菌分离 采用涂布平板法对酵母菌进行分离。

1.2.1.2 酵母菌鉴定 进行形态学和分子生物学鉴定。

1.2.2 摇瓶培养条件优化 挑取斜面酵母保存菌株，置于20 mL已高压灭菌的麦芽汁液体培养基中，于25℃、110 r/min条件下培养40 h，制成种子液备用。取1 mL种子液于100 mL麦芽汁液体培养基中，于25℃、110 rmin条件下培养40 h，备用。利用L9(33)正交试验设计的方法，从温度、pH及取样时间对酵母摇瓶培养条件进行优化筛选，为发酵罐扩大培养工艺研究奠定基础(表1)。

表1 正交试验因素设计

1.2.3 发酵罐扩大培养工艺研究 菌种经过种子液和摇瓶的初步逐级扩大培养后，接着进行10 L发酵罐扩大培养条件优化研究，在扩大培养过程中，经过静息期、对数生长期、饱和期、死亡期等阶段。在静息期期间，将发酵罐转子转速调至50 r/min～100 r/min，缓慢转动4 h～5 h后，再慢慢调转子转速至试验值，这样既可使菌适应新环境，充分的与麦芽汁培养基混合，同时，也可以避免剪切力过大造成的酵母菌死亡。采用正交试验设计[7]，从转速、接种量和装液量方面进行优化(表2)。具体操作步骤如下：首先挑取斜面保存酵母菌株制备种子液20 mL，将此种子液以10 mL/L接种量接入250 mL的摇瓶中，发酵液备用。将发酵罐清洗干净后，罐内不装任何液体，121℃蒸汽灭菌 20 min[8]，待冷却后，向罐中加入液体培养基，安装校准过的pH及DO电极，与罐体一起115℃灭菌20 min～25 min，待罐中培养基温度冷却至20℃时，在发酵罐火焰圈的保护下，无菌接种种子液，慢慢调整转子，加大至试验设计转速，再通过操作控制其各个关键因素(接种量、转速、装液量、温度、pH及时间等)进行发酵[9]；每24 h取样1次，用生理盐水进行10倍稀释，利用血细胞计数法测定其菌浓度，直至发酵结束。

表2 正交试验因素设计

2 结果

2.1 酵母的分离鉴定结果

在麦芽汁琼脂培养基上酵母菌为乳白色,圆形，边缘整齐，有光泽，平坦的菌落；显微镜观察时，菌株细胞多呈椭圆形或长卵形，细胞为芽殖，不形成菌丝，无掷孢子和子囊子孢子。

2.1.1 酵母的生理生化鉴定结果 结果表明，该菌可发酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖和棉子糖，不能发酵乳糖、木糖、纤维二糖和海藻糖；在碳同化试验中，可同化葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖和甘露糖，不同化纤维二糖、D-木糖、密二糖、海藻糖和L-阿拉伯糖；在氮同化试验中，可同化(NH4)2SO4，不同化KNO3；醇类同化试验中，可同化乙醇，不同化山梨醇。以上特征符合酿酒酵母的特性，归属为酿酒酵母属。

2.1.2 酵母的分子生物学鉴定 通过常规PCR对分离驯化酵母菌菌株进行26 S rDNA扩增，得到长度约610 bp片段(图1)，与预期片段大小相符。将其测序后得到的序列通过NCBI网站BLAST比对分析，结果发现，分离出的驯化酵母26 S rDNA与原始酵母菌株的同源性为100%，表明所分离的驯化的菌株与原始酵母为同一菌株SaccharomycescerevisiaeS 288c，无变异。将测序得到的序列提交至GenBank，获得的登录号为NC-001144.5[10]。

M.DNA标准DL 1 000；1、2.酵母原始菌株；3、4.酵母驯化株

M.DNA Marker DL 1 000 ；1，2.Original yeast strains；3，4.Domesticated yeast strains

图1菌株26 S rDNA电泳图

Fig.1 Electrophoresis of 26 S rDNA amplification products of the strain

2.2 摇瓶培养条件优化结果

R值可以判断各因素对试验指标的影响主次，R值越大，此因素水平在本次试验中的影响越大。由表3可知，对试验菌含量影响因素从大到小为：温度>pH>取样时间。从T值和均值中选择平均数大的水平A1、B3、C2作为分析最佳工艺的参考。由表4方差分析表表明，A因素因水平的不同，其平均结果差异显著(P<0.05)，而B、C结果差异不显著。参考从正交试验结果表中选择平均数大的水平组合A1B3C2，因该组合在本次试验方案中不存在，所以，根据菌含量最大原则，将方案中的最佳处理水平3号进行验证试验[10]，验证结果为3.00×108CFU/mL，得出摇瓶最佳试验条件：培养温度25℃，pH为6，取样时间56 h。

表3 正交试验结果

注：Ti为各因素同一水平试验指标之和，R指因素水平的不同造成试验指标的变异。

Note：Tiis the sum of various factors in the same level; R refers to variation of test index in different factor levels.

表4 方差分析

注：P<0.05表示差异显著；P>0.05表示差异不显著。

Note：P<0.05 means significant differernce；P>0.05 means no significant difference.

2.3 酵母发酵罐扩大培养工艺研究结果

由表5可知，因试验系数R(B)>R(A)>R(C)，所以对试验影响大小因素的排序为B>A>C，即接种量>转速>装液量。从表6中T值选择平均数大的水平A3、B3、C3组合作为筛选最佳工艺的参考条件。方差分析表明，此模型结果差异不显著。将方案中的最佳处理水平9号进行验证试验，验证结果为2.80×108CFU/mL，从而得出发酵罐最佳工艺条件：转速200 r/min，接种量50 mL/L，装液量4.5 L。

表5 正交试验结果

注：Ti为各因素同一水平试验指标之和，R指因素水平的不同造成试验指标的变异。

Note：Tiis the sum of various factors in the same level; R refers to variation of test index in different factor levels.

3 讨论

啤酒酵母因其培养物富含多种氨基酸、维生素、矿物质及多种生物活性因子和一些消化酶等多种有利于动物生长且能改善动物肠道微生态平衡的成分,具有广阔的前景，越来越多的被应用于微生态制剂，其涉及领域包括临床应用[12]、养殖业等。有研究发现，酵母培养物可有效改善反刍动物机体抗应激能力，提高动物生产性能，如在对夏季生长育肥猪生长性能观察研究中，发现添加酵母培养物对生长育肥猪的日增重、体重的整齐性有一定的改善[13]，

表6 方差分析

注：P<0.05表示差异显著；P>0.05表示差异不显著。

Note：P<0.05 means significant differernce；P>0.05 means no significant difference.

同时，酵母培养物能够促进蛋雏鸡免疫器官的发育，提高其器官指数[14]。本次试验通过对酵母培养物的扩大培养工艺的研究，将其作为预防和治疗仔猪腹泻的微生态制剂，为下一步具体的临床试验提供原料，同时也为下一步的规模化生产提供理论数据。

林同柱[15]以法夫酵母为出发菌株，通过改变发酵工艺，在5 L和50 L发酵罐中进行了逐步扩大工艺试验的研究。本次试验在摇瓶培养确定的优化条件基础上，在10 L发酵罐中研究了装液量、接种量及转速对啤酒酵母发酵过程的影响，通过正交实验筛选出发酵罐中最佳的生产工艺为：转速200 r/min、接种量50 mL/L及装液量4.5 L，此条件下酵母菌含量最高达到2.80×103CFU/mL。发酵罐扩大培养条件优化试验中，解决了随着发酵规模扩大，因为发酵罐溶解氧、二氧化碳含量、剪切力等因素造成的目标产物产量下降的影响，有利于提高工业发酵的生产效率[5-6]。笔者认为，目前所采用的发酵条件还有较大优化空间，如选育活力更强的菌株[16]，加快酵母生长速率，优化培养基配方，进行分批补料[17]等，下步试验也将针对这些问题进行设计，以期能够得到更优化的发酵结果。

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IsolationandIdentificationofaDomesticatedBeerYeastStrainandOptimizationofItsExtendedCultivationConditions

XU Jin-qiang1,2,LIANG Hong-yan1，2，ZHAO Wu-jing1,WU Zhong-yong1, CHEN Xin1，2，LI Yu-hui1，2,PU Wan-xia1

(1.LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceuticalDevelopmentMinistryofAgriculture，KeyLaboratoryofNewAnimalDrugProjectofGansuProvince，Lanzhou，Gansu，730050，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou，Gansu，730070，China)

To screen a domesticated brewer's yeast and to optimize the fermentation process,and to provide experimental data for future mass production.Yeast with good growth ability was isolated and selected from the wort culture medium for morphological, biochemical and molecular biology identification.The orthogonal experiment design was used to optimize the temperature, pH, sampling time and speed of the fermentation tank,liquid volume and inoculation amount.The optimum culture was as follows:the speed was 200 r/min, the inoculation amount was 50 mL/L and the volume of liquid was 4.5 L.The content of live yeasts was 2.8 ×108CFU/mL.The performance was the same before and after domestication.Optimization of the fermentation technology of beer yeast fermentation tank expansion process provided a theoretical reference for large-scale production.

domesticated yeast;biochemical identification; molecular identification; fermentation tank;enlarged culture

2016-12-02

公益性行业(农业)科研专项(201303038-4)

徐进强(1989-),男,陕西汉中人,硕士,主要从事微生物学与生物制药研究。*

Q949.326.1

:A

:1007-5038(2017)09-0005-05