云南地区非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因突变与临床病理特征的关系

杨长绍，杜亚茜，丁晓洁，杨延龙，李 权，郭银金，刘俊熙，周永春

云南地区非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因突变与临床病理特征的关系

杨长绍，杜亚茜，丁晓洁，杨延龙，李 权，郭银金，刘俊熙，周永春

目的 探讨云南地区非小细胞肺癌外周血中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突变及与临床病理特征的关系，为该地区的肺癌个体化靶向治疗奠定基础。方法 应用突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system, ARMS)检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)外周血中EGFR基因第18、19、20及2l外显子突变情况，统计分析各类突变与患者临床病理特征的相关性。结果 在364例患者中，EGFR基因突变者93例(25.5%)。其中EGFR 18 G719X突变占3.2%(3/93)，EGFR 19缺失突变占48.4%(45/93)，EGFR 20 S768I、T790M、20ins突变分别占3.2%(3/93)、2.2%(2/93)、3.2%(3/93)，EGFR 21 L858R、L861Q突变分别占26.9%(25/93)、1.1%(1/93)；双突变比例占11.8%，其中3例样本3.2%(3/93)存在G719X、S768I双突变，4例样本4.3%(4/93)存在19Del、T790M双突变，1例样本1.1%(1/93)存在19Del、L858R双突变，1例样本1.1%(1/93)存在L858R、S768I双突变，2例样本2.2%(2/93)存在S768I、T790M双突变。EGFR基因突变与患者性别、临床分期、组织学类型相关(P<0.005)，而与患者年龄、是否吸烟无明显相关(P>0.05)。结论 云南地区ⅢB～Ⅳ期NSCLC患者外周血中，女性腺癌突变率较高，且该地区NSCLC患者外周血EGFR基因突变存在外显子19缺失突变为主及双突变率较高的特征。使用ARMS技术检测NSCLC患者外周血EGFR基因突变可为临床使用EGFR-TKIs提供准确的指导。

肺肿瘤；非小细胞肺癌；表皮生长因子受体；外周血；突变扩增阻滞系统

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，全球每年因肺癌死亡的人数超过100万，其中非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)最常见，占全部肺癌的80%～90%[1]。我国肺癌病死率较高，而云南的肺癌发病率与病死率位居国内榜首，存在区域性点状高发、女性高发的特征。分子靶向治疗被认为是治疗晚期NSCLC的主要方法，其中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突变状态是决定EGFR-TKIs疗效最重要的预测指标，检测EGFR基因突变状态是决定患者是否能够应用EGFR-TKIs治疗的先决条件[2]。目前肿瘤组织样本仍是获取肿瘤基因相关信息的主要来源，然而大部分患者就诊时已是晚期，组织标本获得比较困难、组织异质性及无法动态监测等诸多因素限制了有效的EGFR基因突变检测，为临床医师是否选择使用TKIs治疗带来困难。相关研究报道[3]，实体肿瘤患者的外周血中存在来源于凋亡、坏死肿瘤细胞的游离DNA。多项回顾性和前瞻性研究也表明，当肿瘤组织难以获取时，血液循环游离或肿瘤DNA(cf/ctDNA)检测是突变分析合适的替代品[4-5]。《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》明确指出：无法获取足够肿瘤组织及细胞学标本的晚期肺腺癌患者，可用血液标本进行EGFR基因突变检测。本实验应用突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system, ARMS)检测NSCLC患者外周血EGFR突变状态，探讨云南地区NSCLC患者外周血EGFR基因突变的流行状况，同时与患者临床病理特征进行相关性分析，为不能进行组织EGFR突变检测的患者使用分子靶向治疗提供证据。

1 材料与方法

1.1 材料 选取云南省肿瘤医院2015年11月～2016年9月期间存档的NSCLC Ⅱb～Ⅳ期患者外周血液标本364例。364例NSCLC患者中，男性217例(59.6%)，女性147例(40.4%)；中位年龄60岁(26～86岁)，其中≥60岁者185例(50.8%)，<60岁者179例(49.2%)；病理分型：腺癌254例(69.8%)，非腺癌110例(30.2%)；临床分期：ⅡB～ⅢA期76例(20.9%)，ⅢB～Ⅳ期288例(79.1%)；曾经或正在吸烟者165例(45.3%)，从未有过吸烟史者199例(54.7%)。

荧光定量PCR仪(Stratagene Mx3000P)购自安捷伦科技公司，微量紫外分光光度计(Nano Drop 2000)购自美国Thermo公司，核酸提取试剂Circulating DNA Kit(Spin Column)及人类EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)均购于厦门艾德生物公司。

1.2 样本处理及DNA提取 用含EDTA抗凝剂采血管，抽吸体积为10 mL外周血，立即将采集好血样的采血管轻柔地上下颠倒混匀；然后2 000g4 ℃离心10 min，取上清，将获得的上清再8 000g4 ℃离心10 min，取上清，此上清即为血浆。按Circulating DNA Kit(Spin Column)说明书提取DNA，所提取的DNA保存于-20 ℃冰箱备用。

1.3 ARMS 根据试剂盒说明书检测EGFR基因突变。分别取42.3 μL样品DNA、阳性及阴性质控品，加入2.7 μL Taq酶，混匀后加入八联PCR管中，每管5 μL。每次反应均设置阳性及阴性对照。PCR反应参数：第一阶段：95 ℃ 5 min，1个循环；第二阶段：95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15个循环；第三阶段：93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31个循环；并在第三阶段60 ℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号。突变结果根据说明书判读原则进行判读。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析EGFR基因突变与临床分期、患者性别、年龄、组织学类型、有无吸烟等临床病理特征的相关性，χ2检验检测结果是否具有统计学意义，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR基因突变频率与类型 364例患者中，EGFR基因突变患者93例(25.5%)。其中EGFR 18 G719X突变占3.2%(3/93)，EGFR 19缺失突变占48.4%(45/93)，EGFR 20 S768I、T790M、20ins突变分别占3.2%(3/93)、2.2%(2/93)、3.2%(3/93)，EGFR 21 L858R、L861Q突变分别占26.9%(25/93)、1.1%(1/93)；且有3例标本(3.2%，3/93)存在G719X、S768I双突变，4例标本(4.3%，4/93)存在19Del、T790M双突变，1例标本(1.1%，1/93)存在19Del、L858R双突变，1例标本(1.1%，1/93)存在L858R、S768I双突变，2例标本(2.2%，2/93)存在S768I、T790M双突变(图1)。

图1 云南地区非小细胞肺癌患者 外周血EGFR基因突变分布

2.2 EGFR基因突变与患者临床病理特征的相关性 147例女性患者中，52例(35.3%)有EGFR基因突变，明显高于男性患者(18.9%)(P<0.001，表1)。ⅢB～Ⅳ期NSCLC患者88例(30.6%)有EGFR基因突变，显著高于ⅡB～ⅢA期患者(6.6%，P<0.001)。腺癌患者EGFR基因突变率高于非腺癌患者(33.5%vs7.3%)，差异有显著性(P<0.001)，而与年龄、是否吸烟无明显相关(P>0.05，表1)。

表1 云南地区外周血EGFR突变与临床病理特征的相关性[n(%)]

3 讨论

EGFR基因位于人第7号染色体p13-q22区域，全长约20万个碱基，共有28个外显子，分别编码胞外区、跨膜区以及胞内区三个部分，共1 186个氨基酸，其糖基化蛋白的相对分子质量为17.0×104，胞内区具有络氨酸激酶活性，负责将胞外信号传递到胞内。EGFR可通过与配体结合后自动激活其同源或异源二聚体以及酪氨酸酶的自身磷酸化，从而导致其下游：Ras→Raf→MAPK和PI3K→PKC→IKK途径的激活。这些信号途径的激活可导致细胞增殖、生存、侵袭和转移以及新生血管的形成，是许多恶性肿瘤的发病机制、进展恶化、预后差的原因。大量研究表明[6-7]，EGFR基因第18、19、21外显子发生突变的NSCLC患者服用EGFR-TKIs类药物的疗效较好，而EGFR野生型患者则无法从中获益。因此，检测肺癌患者EGFR基因突变状态，对是否应用EGFR-TKI药物及疗效预测意义重大。肿瘤组织样本(手术、活检、细胞蜡块)是检测晚期NSCLC EGFR突变状态最适合的样本来源。然而并非所有患者都能提供足够的组织样本，可通过经支气管镜、肺穿刺活检或胸腔积液标本来进行突变检测，但仍不能覆盖所有晚期患者。目前已有大量的研究证实[5,8]，外周血游离DNA中EGFR基因突变状态与肿瘤组织中的EGFR基因突变状态具有高度的相关性。且2014年9月欧洲药品管理局已批准可采用ctDNA标本来评估EGFR突变状态；中国国家食品药品监督管理局在2015年2月也已批准Gefitinib说明书更新，在推荐所有NSCLC患者的肿瘤组织都应进行EGFR突变检测基础上，补充了如果肿瘤标本不可评估，则可使用从血液(血浆)标本中获得的ctDNA。 ctDNA是指人体血液循环系统中不断流动的携带一定特征(包括突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常、甲基化等)来自肿瘤基因组的DNA片段。ctDNA的主要来源包括坏死的肿瘤细胞、凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞及肿瘤细胞分泌的外排体。

云南地区肺癌发病率与病死率一直位居国内榜首，与全球及我国其他省份的肺癌高发不同，云南的肺癌表现为区域性点状高发，主要集中在个旧和宣威两个地区[9]。分析其原因，除烟草暴露外，室内污染、职业性暴露与肺癌发病有重要的关系。调查发现，宣威地区肺癌的高发与工业污染无明显关系，但生活燃料、室内燃煤空气污染却与肺癌的发病密切相关；个旧地区锡矿工人中肺癌发病率异常主要与职业性暴露因素相关，如氡子体、砷和粉尘等。本组实验的目的是通过检测外周血游离DNA中EGFR基因突变状态，探讨云南地区NSCLC患者外周血EGFR突变与患者临床病理特征的相关性分析，为不能进行组织EGFR突变检测的患者使用分子靶向治疗提供证据。

目前血液EGFR基因突变检测方法主要有ARMS技术、二代测序技术(next generation sequencing, NGS)、数字PCR等[5,10-11]。NGS技术扩展了基因突变检测的深度和广度[10]，但其临床转化应用更需要大量数据积累。数字PCR在血浆EGFR突变检测上具有较高的灵敏度和特异度[11]，但目前报道的该方法检测EGFR突变位点相对有限，仍处在摸索、累积经验阶段，其对操作人员和环境均有较高的要求，未来应用于临床尚需大规模临床数据验证。目前成熟且常用检测血液EGFR基因突变的方法是ARMS技术，该技术检测血浆相比于肿瘤组织其EGFR敏感型突变的灵敏度在65%～88%，特异度在90%～100%，且已被欧盟批准用于指导EGFR-TKIs治疗的血液检测方法[5,8]。

本组实验中ⅡB～ⅢA期NSCLC EGFR基因突变发生率为6.6%(5/76)，ⅢB～Ⅳ期为30.6%(88/288)，两者之间差异有统计学意义(P<0.001)。多项研究表明[6,12]，在女性、腺癌和非吸烟者中EGFR基因的突变率较高。本组实验亦发现在腺癌患者中EGFR的突变率(33.5%vs7.3%)明显高于非腺癌患者，两组之间差异有统计学意义(P<0.001)；女性患者EGFR基因突变占40.4%(147/364)，突变率(35.3%vs18.9%，P<0.001)显著高于男性患者，与之前的研究报道相符。但吸烟患者EGFR基因突变率(21.8%)与不吸烟患者突变率(28.6%)相比，两组差异无统计学意义(P>0.05)。与相关文献报道[12]不吸烟的NSCLC患者EGFR突变率高于既往吸烟者存在差异，可能是云南部分地区主要以烟煤为主要生活燃料，烟煤燃烧后排放出含有大量以苯并(A)芘为代表的致癌性多环芳烃类物质(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)的特殊煤烟污染环境有关。

在中国EGFR基因的突变存在显著的地域差异，据文献报道[13-14]，台湾地区的EGFR基因的突变以外显子21为主，云南和广东地区以外显子19为主；本组结果显示，云南地区NSCLC患者外周血中，EGFR基因的突变主要发生在19号外显子，与报道一致。EGFR基因敏感性突变中最常见、与临床疗效最为相关的突变包括19外显子缺失突变及21外显子L858R突变，这两类经典突变占所有EGFR突变的62%～83%[15]；本组364例患者外周血中EGFR基因19外显子缺失突变及21外显子L858R突变占总突变的76.3%(71/93)，与之前的研究报道相符。目前20外显子的T790M突变的作用也比较明确，即与EGFR-TKIs原发及继发耐药相关。本组中T790M突变占2.2%(2/93)，均为原发耐药；另有6例标本(6.5%，6/93)存在继发耐药突变，其中4例标本(4.3%，4/93)存在19Del、T790M双突变，2例标本(2.2%，2/93)存在S768I、T790M双突变。少见突变即除外19缺失突变、L858R、T790M突变以外的所有突变，如E709、G719、S768、L861等位点的氨基酸替换突变[16]。本组少见突变位点中最常发生的突变位点为G719X及S768I。G719X位于EGFR基因18外显子第719位的甘氨酸(Glysine，G719)，正好坐落在ATP结合活化位点附近的磷酸化结合环(phosphate-binding loop, P-loop)上，该位点氨基酸的核苷酸密码子为GGC，当该核苷酸密码子发生点突变时，甘氨酸可突变为丙氨酸(Alanine, G719A)、丝氨酸(Serine, G719S)和半胱氨酸(Cysteine, G719C)；本组中G719X(X代表A、C或S)突变约占总突变的6.5%(6/93)，合并其他突变者3例，G719X发生双突变的概率为50%。S768I突变是发生在EGFR基因20外显子768号密码子的点突变(G>T)；本组实验发现S768I单突变3例，合并其他突变者6例，S768I发生双突变的概率为66.7%，这与Chen等[17]报道在EGFR基因G719、S768、T790、L861等区域更易合并双突变的结果部分一致。L861Q突变是由2828位点的T被A取代所致，本组有1例标本1.1%(1/93)存在L861Q突变，与报道[18]EGFR-L861Q仅占EGFR突变阳性的1.12%一致。

在云南地区NSCLC中外周血EGFR基因的突变以外显子19的缺失突变为主，突变率以腺癌和女性较高。且该地区EGFR少见突变及双突变相对其它地区较高，EGFR少见突变作为特殊类型的EGFR突变，不同亚型对EGFR-TKIs的敏感性不尽相同。因此，检测EGFR非常重要，但对于部分患者，特别是ⅢB～Ⅳ期患者很难取到组织标本，为临床医师是否选择使用TKIs治疗带来困难。血液ctDNA EGFR检测具有无创、便捷、实时可获取的特点，能在一定程度上帮助解决组织样本量不足、异质性及反复动态活检的问题，可作为组织检测的补充。但目前血液ctDNA EGFR检测尚存在临床应用范围、适用人群、检测方法等方面标准的不统一，如何有效合理的应用血液EGFR检测已成为临床上亟待解决的问题。

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Relationship between EGFR gene mutation and clinicopathologicalfeatures in peripheral blood of patients with non-small celllung cancer in Yunnan area

YANG Chang-shao, DU Ya-xi, DING Xiao-jie, YANG Yan-long, LI Quan, GUO Yin-jin, LIU Jun-xi, ZHOU Yong-chun

(TumorResearchInstitute,theTumorHospitalofYunnanProvince,KeyLaboratoryofLungCancerResearchofYunnanProvince,Kunming650106,China)

Purpose To investigate the prevalence of EGFR mutation in circulating cell-free DNA in non-small cell lung cancer (NSCLC) patients of Yunnan province and its relationship with clinical pathological characteristics, which can provide foundations for individualized targeted therapy of lung cancer in this area. Methods Amplification refractory mutation system (ARMS) was used to detect the EGFR exon 18, 19, 20 and 21 mutation in circulating cell-free DNA. The relationship between EGFR mutation and clinical characteristics were further analyzed. Results 93 patients (25.5%) harbored circulating EGFR mutations among 364 patients. The mutation rates of EGFR 18 G719X, 19del, 20 S768I, T790M, 20ins were 3.2% (3/93), 2.2% (2/93) and 3.2% (3/93) respectively. EGFR 21 L858R and L861Q mutation rates were 26.9% (25/93) and 1.1% (1/93), respectively. Three patients (3.2%, 3/93) harbored G719X+S768I double mutation, four patients (4.3%, 4/93) harbored 19Del+T790M mutations. 19Del+L858R, L858R+S768I, and S768I+T790M mutation rates were 1.1%(1/93), 1.1%(1/93)and 2.2%(2/93)respectively. Conclusion The EGFR mutation rate of female and adenocarcinoma patients is higher in patients with stage ⅢB-Ⅳ NSCLC in Yunnan area. 19Del is the major mutation type and double exon mutation is an obvious characteristic in NSCLC patients of Yunnan province. EGFR mutation detection in circulating cell-free DNA by ARMS method is feasible to screen patients receiving EGFR-TKIs treatment.

lung neoplasms; non-small cell lung cancer; epidermal growth factor receptor; peripheral blood; amplification refractory mutation system

国家自然科学基金(81460441)、云南省应用基础研究面上项目(2016FB145)、云南省卫生科技计划项目(2014NS001)

云南省肿瘤医院肿瘤研究所/云南省肺癌研究重点实验室，昆明 650106

杨长绍，男，技师。Tel: (0871)68179504，E-mail: yangchangshao@126.com 周永春，女，博士，副主任医师，硕士生导师，通讯作者。Tel: (0871)68179505，E-mail: chungui7625@163.com

时间：2017-8-20 15:27 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.010.html

R 734.2

A

1001-7399(2017)08-0874-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.010

接受日期：2017-04-27