Mirco-CT在大鼠肾结石研究中的应用价值探讨

褚 浩，王勤章，钱 成，王议鹤，吴 双，钱 彪

Mirco-CT在大鼠肾结石研究中的应用价值探讨

褚 浩1，王勤章2，钱 成2，王议鹤2，吴 双2，钱 彪2

肾结石；动物模型；HE染色；Micro-CT

肾结石是泌尿外科常见疾病，发病率较高。围绕肾结石病因学研究所建立的动物模型已经较为成熟，以往肾结石动物模型的研究多是从生化、病理甚至蛋白角度出发，临床多采用X线、CT等影像学技术对泌尿系结石进行诊断，而微计算机断层扫描技术(micro computed tomography, Mirco-CT)是一种采用了与普通临床CT不同的微焦点X线球管，对活体小动物或多种硬组织进行扫描成像分析的技术，该技术在一些基础研究领域已有所建树[1-2]，本实验首次采用Mirco-CT对肾结石大鼠模型进行扫描，并与HE染色的病理结果进行比较，探讨这种新方法的可行性，希望能为以后肾结石的相关研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂与器材 选取6周龄左右SPF级雄性Wistar大鼠40只，体重(200±20) g，购自新疆医科大学实验动物中心[合格证号SCXK(新) 2013-0001]。各组大鼠均先适应性饲养1周，随机分成对照组(A组20只)和结石组(B组20只)。氯化铵(天津永晟公司)，乙二醇(天津福晨公司)，基本饲料(石河子大学实验动物中心)、多功能光学显微镜及图像采集系统(BX40，日本Olympus)、Mirco-CT(skyscan1176，比利时Antwerpen)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肾结石模型建立及实验取材 参照李笑然等[3]提供的造模方法建立动物模型，B组给予1%乙二醇饮水+2%氯化铵2 mL每天，A组正常饮水+饮用水2 mL每天，各组灌胃15天，8周后将大鼠全部处死，收集双侧肾脏标本，观察肾脏大体情况，用10%中性福尔马林固定。

1.2.2 记录大鼠一般情况 于第8周观察各组大鼠的饮食饮水、精神状态、行为活动等。

1.2.3 Mirco-CT扫描 将肾脏标本固定在放射源和照相机之间，沿垂直长轴作0.9°～180°旋转，使用Mirco-CT进行扫描，扫描条件：功率8 W、电压30 kV，电流300 μA，分辨率35 μm 2 000×1 336，Filter=0.5 mmAL，以确定是否存在高密度结石样物质，并进行拍照及三维重建。

1.2.4 病理组织学检查 将肾脏标本石蜡包埋制片后固定于载玻片上，HE染色，光镜下观察结晶的形成情况，参考文献提供的肾脏结晶分级判定标准进行统计[4]，结晶分级：0度为阴性，Ⅰ～Ⅳ度为阳性，以HE染色为金标准，计算Mirco-CT对结石诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及准确率。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计数资料比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义，结果一致性进行Kappa检验。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 8周时A组大鼠进食饮水良好、活跃好动；同时B组大鼠进食偏少，活动减少，精神萎靡，个别大鼠出现血尿，实验期间2只死亡。

2.2 Mirco-CT扫描检查 A组大鼠肾脏Mirco-CT初步扫描显示肾脏轮廓清晰，边缘无毛糙，重建后三视图图像肾盂、肾皮质及肾髓质均未见高密度影；B组大鼠肾脏扫描可见颗粒样高密度影分布于各肾盏中，重建后三视图可见高亮片状影随机分布于各平面的肾髓质结构中，结石最大体积见图1。B组36例肾脏中检出7例，检出率为19.4%，A组40例肾脏均未检出，B组的检出率较A组高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 各组大鼠肾脏结晶的形成情况及肾脏病理改变

2.3.1 眼观 与A组相比，B组肾脏出现不同程度肿大，颜色变浅或发白，部分肾脏可见少数颗粒斑点分布于肾脏表面。

2.3.2 镜检 A组大鼠肾脏内无草酸钙结晶沉积，未见明显病理学改变。B组较A组肾小管有不同程度的扩张，肾小管上皮细胞脱落坏死，肾皮质可见草酸钙结晶形成(图2)，B组36例肾脏中结晶0级10例，Ⅰ级10例，Ⅱ级8例，Ⅲ级6例，Ⅳ级2例，阳性率为72.2%，A组40例肾脏均为阴性，B组成石率较A组高，差异有统计学意义(P<0.05)。与HE染色相比，Mirco-CT的结石诊断灵敏度为23.1%、特异度为90%、阳性预测值为85.7%、阴性预测值为31.0%、准确率为41.7%，根据Kappa一致性检验，Kappa值为0.083(95%CI：-0.078～0.256)，表明Mirco-CT与HE染色对结石检出率一致性较差(表1)。

图1 两组大鼠肾脏Mirco-CT扫描图

ab

图2 两组肾脏石蜡切片：a. A组大鼠肾脏内无草酸钙结晶沉积，未见明显病理学改变；b. B组肾小管有不同程度的扩张，肾小管上皮细胞脱落坏死，肾皮质可见草酸钙结晶形成

表1 HE染色和Mirco-CT检测结果对比

3 讨论

经典的动物肾结石模型研究方法采用HE染色病理切片等方法研究尿中晶体黏附、生长和聚集于肾小管上皮细胞，并在肾内或肾乳头表面形成结石斑，并经过一系列反应最终生成肾结石的动态过程[3,5]。从微观的细胞损伤发展到结晶聚集生成进而形成宏观的肾结石，上述病理方法虽然能够较好的发现肾结石形成中的细胞结构变化，但缺乏对后期结石形成后宏观整体意义上的描述，因此，寻求一种更直观的检查方法来观察肾结石形成部位、数量等情况，评价动物模型建立效果。

Mirco-CT是近年来发展较快的一种高分辨率三维定量分析技术，其观察和测量骨组织相对于传统的组织切片技术具有明显的优势[6]，因此在分析研究骨骼等高密度标本的实验研究领域得到一定应用[7-9]。鉴于结石具有高密度物理特性，因此在以往相关研究的基础上，通过建立大鼠肾草酸钙结石模型[10-11]，尝试利用Mirco-CT技术，定性分析肾结石大鼠肾脏成石情况，同时与HE染色结果进行横向对比，探讨Mirco-CT的应用价值。

由于氯化铵具有肾毒性，8周时B组大鼠体质较A组明显下降，实验期间B组2只大鼠死亡，但不影响肾脏样本量的可信度。实验发现B组大鼠肾脏的HE染色病理切片肾小管内出现了结石结晶，结晶形成率明显高于A组，差异有统计学意义，说明造模成功，同时B组大鼠肾脏Mirco-CT平扫及重建均显示出高密度影，且检出率高于A组，差异有统计学意义，证明Mirco-CT用来验证肾结石造模效果具有一定意义，实验中有1例出现肾脏Mirco-CT阳性而病理阴性，考虑切片部位误差引起，也说明即便是HE染色，也可能存在假阴性。以HE染色为金标准，计算Mirco-CT对结石诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及准确率，得出Kappa值为0.083，表明Mirco-CT与HE染色对结石检出率一致性较差，分析其原因：一方面考虑到两种检测手段关注的是结石形成的不同时期，HE染色着重描述前期结晶形成时的肾脏细胞损伤，Mirco-CT观测的是后期结晶大量堆积后转化为结石的肾脏整体，甚至在早期结石颗粒形成较少时，Mirco-CT也可能存在一定的漏诊，此外，8周的造模时间对于较明显的结石形成也可能稍显仓促，另一方面因对Mirco-CT的使用经验不足、操作水平有待提高，参数设置可进一步调整，这些均有待于进一步探讨分析。

这正如临床上病理检查能发现许多CT及X线不能发现的病变，而CT及X线仍然有自己擅长的领域一样，Mirco-CT在显示结石部位、形态、数量，多角度还原肾脏结石三维空间物理性质，建立高质量病灶整体影像等方面具有后者不可比拟的优势。值得注意的是Mirco-CT扫描过程中活体动物的轻微活动均可造成相当程度的伪影，同时大鼠的毗邻腹腔脏器存在干扰因素，斟酌之下，作者初步采用离体肾脏观测方式，取得了一定的效果，但也说明该项研究对实验技能和思路要求较高。必须指出Mirco-CT不能完全取代组织病理与生物学检测，它只能提供肾脏及结石的结构和空间构成信息，而不如组织病理学与生物学检测那样可以描述细胞损伤与结晶形成的相互过程，即不能描述结石发生的机制。所以，在肾结石以致泌尿系结石的研究中，可充分利用Mirco-CT在物理形态测量方而的优势，结合组织功能与形态测量的结果，综合判断肾脏功能和结石结构变化的成因。

参考de Oliveira等[12-13]的研究，作者将研究采用增加样本量、延长造模时间、造影剂标记等方法，进一步检测结石的密度、体积、三维立体图像等结果，与以往平面的组织病理切片测量相比，Mirco-CT所得三维体视学参数更能真实反映肾脏及结石的真实性状，可以为结石疾病的发病机制提供更为详实的物理数据，为动物肾结石模型及疾病的诊断、测量、手术路径的设计、模型分析等方面提供更直接、更准确的信息。

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国家自然科学基金(81460140)

1湖北省武汉市第三医院(武汉市同仁医院)，武汉 4300602石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科，石河子 832000

褚 浩，男，硕士研究生。E-mail: 251784865@qq.com 钱 彪，男，硕士，副教授，通讯作者。E-mail: qb2003_2000@163.com

时间：2017-8-20 15:27 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.026.html

R 319； R 692.4

B

1001-7399(2017)08-0929-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.026

接受日期：2017-03-21