siRNA干扰膜联蛋白A1基因对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞增殖的影响

钟雪梅 林一民 李倩倩 邓世山 邵如月 丁 浩

(重庆医药高等专科学校临床医学院，重庆 401331)

siRNA干扰膜联蛋白A1基因对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞增殖的影响

钟雪梅 林一民1李倩倩2邓世山2邵如月 丁 浩

(重庆医药高等专科学校临床医学院，重庆 401331)

目的通过小干扰RNA(siRNA)干扰膜联蛋白(ANX)A1基因在甲状腺乳头状癌TPC-1细胞中的表达，探讨ANXA1对甲状腺乳头状癌细胞生物学特性的影响。方法设计并筛选使用高效的siRNA在甲状腺乳头状癌TPC-1细胞株中特异性干扰ANXA1的表达，然后用CCK8法观察ANXA1干扰后对TPC-1细胞增殖能力的影响。结果筛选的siRNA可高效沉默ANXA1在TPC-1细胞中的表达，显著抑制甲状腺乳头状癌的增殖。结论siRNA干扰ANXA1表达，可抑制甲状腺乳头状癌的增殖，提示ANXA1可能是甲状腺乳头状癌治疗的一个重要的生物学靶标。

甲状腺乳头状癌；膜联蛋白A1；TPC-1细胞；小分子干扰RNA

膜联蛋白(ANX) 是一类高丰度蛋白，有钙依赖性，且能够和带负电荷膜磷脂结合的一种蛋白超家族〔1〕。ANXA1作为ANX家族重要成员之一，参与细胞的各种生理病理过程〔2〕。研究还发现，ANXA1与肿瘤关系非常密切，在很多肿瘤中表达异常且参与肿瘤细胞的增殖、分化、细胞信号和转导以及侵袭等过程，这可能与ANXA1 高度依赖钙磷脂结合蛋白，很多位点可生物再加工，包括被酪氨酸激酶磷酸化、糖基化、乙酰化、磷酸化，增加水解作用，促进重要分子的增殖有关〔3，4〕。甲状腺癌(TC) 是内分泌系统常见肿瘤，它的病理分型有甲状腺乳头状癌(PTC)、甲状腺髓样癌、未分化癌和甲状腺滤泡状癌，其中PTC恶性程度较甲状腺癌其他分化类型低，它的发生发展是多基因、多因素导致的，诊治较困难，且易转移和复发〔5〕。过度诊治可给患者带来身心伤害和负担，其中手术导致的喉返神经损伤引起发声费力、呼吸困难甚至窒息等是甲状腺手术的严重并发症之一。本文拟探索一种新的标记物和治疗方法，提高PTC的诊治，改善PTC患者的生活质量。

1 材料与方法

1.1细胞株 将从深圳百恩维生物公司购买的人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1，在细胞生长90%汇合时进行细胞传代，加入含10%～15%胎牛血清的RPMI-1640培养基，5%CO2、37℃恒温孵箱内培养。根据试验需要进行细胞计数以及细胞的冻存复苏。

1.2ANXA1 siRNA设计 从GenBank中检索出人ANXA1全长序列，遵循引物设计原则，使用Version2.0软件设计出针对ANXA1基因的特异性片段3对及无关序列siRNA片段(NCsiRNA)1对。以上siRNA由广州锐博生物科技有限公司复核并合成。

1.3细胞转染 转染前24 h接种6孔板，将甲状腺乳头状癌TPC-1细胞以(2.5～5)×105/孔的密度接种，使其生长至80%或刚好铺满培养板且处于对数生长期进行转染。选择细胞传代在5代以内的转染，根据Lipofectamine(lip)2000(Invitrogen美国)说明书操作，将带有荧光标记的siRNA转染至TPC-1细胞内。实验分空白组(不转染)，实验组(三对分别转染siRNA)、阴性对照组(转染NCsiRNA)及脂质体组，其中实验组包括ANXA1-siRNA1组、ANXA1-siRNA2组、ANXA1-siRNA3组。操作步骤：稀释siRNA，用250 μl无血清培养基稀释5 μl 的siRNA，轻轻混匀。准备转染试剂：用250 μl无血清培养基加入lip2000脂质体5 μl；将稀释后的siRNA和脂质体lip2000混匀，即每个EP管共510 μl混合液，在室温下孵育15～20 min；将6孔板培养的生长状态良好的细胞移至超净台，先吸出旧培养基，用PBS轻柔洗涤3次，加入1 490 μl无血清培养基；将孵育好的siRNA和lip2000脂质体510 μl加入6孔板中，每孔终体积为2 ml。转染前后避光，于5%CO2、37℃孵箱培养。6 h后换成含血清培养基继续培养。

1.4半定量逆转录PCR(RT-PCR) 先提取细胞总RNA，并鉴定在RNA的完整性。GenBank中检索出人ANXA1和β-actin全长序列，用 Oligo6 软件分别设计引物，以β-actin为内参对照，ANXA1基因上游引物：5′-gTCATCCAAAggTggTCCCg-3′，下游引物：5′-CgCTgTgCATTgTTTCgCTTA-3′，产物大小为153 bp；β-actin上游引物：5′-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′，下游引物：5′-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3′，产物大小为594 bp。将逆转录所得的cDNA模板进行PCR扩增反应。ANXA1及β-actin基因的上下游引物和通过半定量RT-PCR扩增后的产物marker在1.0%～1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，溴酚蓝染色，凝胶成像系统上观察扩增的条带并采集图片，测量灰度值，计算mRNA相对表达量，用图像分析软件PDQuest进行分析。

1.5CCK-8检测细胞活力 CCK-8实验步骤按说明书操作：将TPC-1 细胞以密度(2～2.5)×103/个接种于96孔板，每孔终体积为100～200 μl，分别为ANXA1-siRNA3组、空白组、negative-siRNA组，每组设置8个复孔，待细胞铺满70%～80%时转染。分别在转染后24、48、72、96 h每孔加入CCK-8试剂10 μl，避光置于37℃孵箱中继续培育孵育，时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度不同而不同，TPC-1细胞分别在0.5、1、2、4 h用酶标仪检测，孵育1 h后细胞颜色最深，增殖最多。用酶标仪测定450 nm波长的吸光度(A)值，并根据A值分析细胞活力状况。

1.6统计学分析 采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1荧光显微镜下观察TPC-1细胞表达 ANXA1-siRNA和negative-siRNA在48 h时转染效率达80%以上，转染效率最好。见图1。

2.2各组TPC-1细胞中ANXA1 mRNA水平比较 各ANXA1-siRNA干扰组siRNA1、siRNA2、siRNA3 mRNA表达水平分别是0.51±0.11、 0.49±0.08、0.41±0.14，空白组、脂质体组及阴性对照组的mRNA表达水平为1.34±0.17、1.15±0.098、1.25±0.175 。ANXA1-siRNA干扰组mRNA表达水平较其他组明显下降(P<0.05)，其中ANXA1-siRNA3下降最明显；而空白组、脂质体组及阴性对照组的mRNA表达无明显变化(P>0.05)。

2.3siRNA干扰ANXA1基因后对TPC-1细胞活力的影响 在转染后的不同时间点，空白组及negative-siRNA组比较细胞增殖无明显差异(P>0.05)；而转染48、72、96 h后，ANXA1-siRNA3组细胞增殖低于空白组及negative-siRNA组(P<0.05)，见表1。

表1 不同转染时间段各组细胞的OD值(±s)

与空白组比较：1)P<0.05;与negative-siRNA组比较：2)P<0.05

图1 荧光显微镜下观察TPC-1细胞转染24 h后图像(×10)

3 讨 论

siRNA由21～25个核苷酸组成，能引起RNA沉寂和抑制靶蛋白的表达。由于siRNA能够高效、快速地敲除基因的表达，对很多疾病(如肿瘤、基因疾病、病毒性干扰等)具有极好的治疗前景。本实验前期的研究中发现，ANXA1蛋白在PTC组织及淋巴结转移组织中高表达，在癌旁正常组织中低表达，并与淋巴结转移和肿瘤大小相关〔6～8〕。靶向治疗已经运用与临床，并显示出很好的治疗前景。这为PTC的研究提供了很好的着眼点，抑制ANXA1基因功能是否影响PTC的生物学特性成为本次的研究目的。

本研究结果显示，设计并合成的siRNA在mRNA水平显著抑制了ANXA1的表达，具有高效性和专一性，进而利用筛选的效率最高的siRNA进行后续研究。siRNA显著干扰了ANXA1蛋白的表达，抑制了甲状腺乳头状癌TPC-1细胞株的增殖能力，提示ANXA1在PTC中可能是一个癌基因。ANXA1属于Ca2+的受体蛋白，当蛋白质磷酸化和磷脂代谢等一些信号蛋白功能失常时，细胞膜和细胞内的信息发生改变，研究推断 ANXA1可能通过各种信号途径，诱导肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化、转移，在肿瘤的发生、发展中起一定的作用〔9〕。 ANXA1在癌组织中高表达，具有促进肿瘤细胞增殖的能力，并有抗癌细胞凋亡的作用。这为PTC的临床治疗提供了新思路，即通过靶向治疗抑制ANXA1蛋白高表达，从而达到控制肿瘤的作用。目前，关于ANXA1研究已成为肿瘤治疗领域的热点。如Babbin 等〔10〕也发现ANXA1在结肠癌表达上调，运用高表达结直肠癌细胞系 SKCO-15，用 siRNA 敲低ANXA1 的表达，显示其能促进结直肠癌细胞系SKCO-15的增殖，且降低结直肠癌细胞系 SKCO-15的侵袭能力。总之，ANXA1通过多种方式参与信号通路和酶的表达，具体机制待深入探讨。

1Perretti M，Flower RJ.Annexin 1 and the biology of the neutrophil〔J〕.J Leukoc Biol，2004；76(1)：25-9.

2Laohavisit A，Davies JM.Annexins〔J〕.New Phytol，2011；189(1)：40-53.

3Perretti M，Acquisto F.Annexin A1 and glucocorticoids as effectors of the resolution of inflammation〔J〕.Nat Rev Immunol，2009；9(1)：62-70.

4Horlacher T，Noti C，de Paz JL，etal.Characterization of annexin A1 glycan binding reveals binding to highly sulfated glycans with preference for highly sulfated heparan sulfate and heparin〔J〕.Biochemistry，2011；50(13)：2650-9.

5Cvejic D，Selemetjev S，Savin S，etal.Apoptosis and proliferation related molecules (Bcl-2，Bax，p53，PCNA) in papillary microcarcinoma versus papillary carcinoma of the thyroid〔J〕.Pathology，2008；40(5)：475-80.

6llsley JN，Nakanishi M，Flynn C，etal.Cytoplasmic phospholipase A2 deletion enhances colon tumorigenesis〔J〕.Cancer Res，2005；65(7)：2636-43.

7Ferlazzo V，Daqostino P，Milano S，etal.Anti-inflammatory effects of annexin-1：stimulation of IL-10 release and inhibition of nitric oxide synthesis〔J〕.Int lmmunopharmacol，2003；3(10-11)：1363-9.

8钟雪梅，陈 敏，邓世山，等.AnnexinA1在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义〔J〕.重庆医学，2015；44(25)：3488-90.

9He ZY，Wen H，Shi CB，etal.Up-regulation of hnRNP A1，Ezrin，tubulin β-2C and Annexin A1 in sentinel lymph nodes of colorectal cancer〔J〕.World J Gastroenterol，2010；16(37)：4670-6.

10Babbin BA，Lee WY，Parkos CA，etal.AnnexinA1 regulates SKCO-15 cell invasion by signaling through formyl peptide receptors〔J〕.J Biol Chem，2006；281(28)：19588-99.

〔2016-12-15修回〕

(编辑 李相军)

InflunenceofsiRNAinterferingANXA1expressiononcytobiologicalcharacteristicspapillarythyroidcarcinomaTPC-1cells

ZHONGXue-Mei,LINYi-Min,LIQian-Qian,etal.

ChongqingMedicalandPharmaceuticalCollege,Chongqing401331,China

ObjectiveTo investigate the effects of ANXA1 on the cytobiological of papillary thyroid carcinoma cells by small RNA(siRNA)knock-down the ANXA1 expression in the papillary thyroid carcinoma TPC-1 cells.MethodsThe designed highly efficient siRNA was used to conduct the specific interference on ANXA1 expression in the papillary thyroid carcinoma TPC-1 cells.Then the influence on the papillary thyroid carcinoma cells proliferation was observed by CCK-8 method.ResultsThe designed siRAN efficiently inhibited the expression of ANXA1 mRNA in papillary thyroid carcinoma cells; furthermore, markedly suppressed the proliferation of papillary thyroid carcinoma cells.ConclusionsThe siRNA interfering ANXA1 could inhibit the proliferation of papillary thyroid carcinoma cells.

Papillary thyroid carcinoma；ANXA1；TPC-1 cells；siRNA

国家自然科学基金资助项目(No：81172496)

林一民(1965-)，女，主任技师，主要从事临床血液体液检验工作。

钟雪梅(1980-)，女，硕士，主要从事内分泌基础与临床研究。

R735.+1

A

1005-9202(2017)16-3920-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.005

1 重庆市肿瘤研究所 2 川北医学院基础医学院