苦参碱通过PKA/CREB信号通路对阿尔茨海默病大鼠认知障碍及神经炎症的调节作用

吕 路 梅 蕊 王 昉 彭 樊

(武汉市精神卫生中心精神科，湖北 武汉 430022)

苦参碱通过PKA/CREB信号通路对阿尔茨海默病大鼠认知障碍及神经炎症的调节作用

吕 路 梅 蕊 王 昉 彭 樊1

(武汉市精神卫生中心精神科，湖北 武汉 430022)

目的探讨苦参碱通过蛋白激酶A(PKA)/CAMP反应元件结合蛋白(CREB)信号通路对阿尔茨海默病(AD)认知障碍及神经炎症的调节作用。方法48只SD雄性大鼠，随机分为假手术组、模型组、苦参碱组。处理7 d后，Morris水迷宫实验检测大鼠认知功能；放射免疫检测大鼠血清及海马组织中炎症因子白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6含量；Western印迹检测胶质细胞标记蛋白如离子钙结合蛋白(Iba)-1、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及PKA/CREB信号通路蛋白表达情况。结果与假手术组相比，模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长，空间探索能力明显下降，Iba-1、GFAP的表达显著增高，炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6含量明显增多，p-PKA及p-CREB表达显著降低(均P<0.01)。与模型组相比，苦参碱组大鼠逃避潜伏期明显缩短，空间探索能力显著增强，Iba-1、GFAP的表达明显降低，炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6的含量明显下降，p-PKA及p-CREB表达明显增强(均P<0.01)。与假手术组相比，苦参碱组各检测指标均无显著性差异(P>0.05)。结论苦参碱能显著改善AD大鼠认知障碍，抑制神经炎症，作用机制可能与PKA/CREB信号通路的活化有关。

苦参碱；阿尔茨海默病；认知障碍；神经炎症；小胶质细胞

阿尔茨海默病(AD)是一种常发于老年人的中枢神经退行性疾病，主要表现为记忆力减退、自理能力下降，同时伴有各种精神类疾病及行为障碍，其发病率随着年龄的增长急剧升高，65岁以上人群发病率约为30%，85岁以上患病率增至65%〔1〕。目前对AD尚无有效的治疗方法。苦参碱是自苦参中提取得到的一种生物碱，具有清热燥湿、利尿等作用〔2〕。苦参碱具有广泛的药理作用，临床上已被用于乙型肝炎的治疗〔3〕。研究发现苦参碱还能防止大鼠肝纤维化，除此之外还具有抗感染、镇痛、抗肿瘤等作用〔4～6〕。但是关于将苦参碱应用于AD治疗的报道很少，相关的作用机制也不清楚。本研究采用β淀粉样蛋白(Aβ)1～42双侧注射大鼠海马区构建AD大鼠模型，利用苦参碱进行治疗，探讨苦参碱对AD大鼠认知障碍、神经胶质细胞活化及炎症因子释放的影响及机制。

1 材料与方法

1.1材料 SD大鼠由华中科技大学同济医学院附属同济医院提供；苦参碱注射液购自广州白云山明兴制药有限公司；Aβ1～42、蛋白酶抑制剂购自美国Sigma；离子钙结合蛋白(Iba)-1单克隆抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体、蛋白激酶A(PKA)单克隆抗体、磷酸化(p)-PKA单克隆抗体、CAMP反应元件结合蛋白(CREB)单克隆抗体、p-CREB单克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗均购于美国Abcaminc；放射免疫试剂盒购自北京福瑞生物公司；Morris水迷宫购自中国医学科学院药物研究所；脑立体定位仪购自日本Nikon。

1.2方法

1.2.1分组及AD模型制备 使用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配制浓度为1 μg/μl的Aβ1～42溶液，37℃恒温孵育7 d，直至溶液凝聚。取48只健康雄性SD大鼠，体重250～300 g，随机分为假手术组、模型组、苦参碱组。大鼠麻醉处理后进行固定，参照《大鼠脑立体定位图谱》对大鼠海马区进行定位。消毒后使用电钻在定位处钻一小孔，垂直缓慢注射10 μl的Aβ1～42溶液，模型组及苦参碱组双侧海马区各注射10 μl，假手术组注射10 μl无菌0.01 mol/L PBS溶液。完成注射后，使用无菌的石蜡封堵针口，并对头皮进行缝合。

1.2.2各组大鼠处理方法 造模后苦参碱组大鼠每日腹腔注射苦参碱注射液40 mg/kg 1次，假手术组和模型组每日腹腔注射等体积的生理盐水，连续处理30 d。

1.2.3Morris水迷宫检测大鼠认知能力 各组大鼠处理7 d后，每组选6只大鼠，随机选择象限面向池壁放入水中，记录各只大鼠寻找到平台所需时间，若大鼠90 s内寻找到平台，让大鼠在平台停留10 s，若大鼠无法在90 s内寻找到平台，取出大鼠置于平台10 s，并计时90 s。训练5 d后，采用不同入水点将大鼠放入水中，记录大鼠寻找到平台的时间。撤除水迷宫中的平台，随机选取入水点将大鼠放入水中，记录90 s内大鼠穿过原平台所在区域的次数，并进行统计。

1.2.4血清及海马组织炎症因子含量检测 每组随机选择6只大鼠麻醉后取心脏采集血液，离心后上清转移至新的离心管中备用。同时，自脑分离出海马组织，匀浆后离心取上清。按照放射免疫试剂盒说明进行操作，分别检测血清及海马组织匀浆液中白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6的含量。

1.2.5提取大鼠海马组织总蛋白 每组随机选择6只大鼠进行处死后取海马组织，每组各取50 mg剪碎后置于离心管中，向离心管中加入500 μl蛋白裂解液及5 μl蛋白酶抑制剂进行匀浆。取0.5 ml匀浆液转移到新的离心管中，加入1 ml蛋白抽提液和10 μl蛋白酶抑制剂，混匀后冰上静置10 min，离心取中间层溶液，加入2%的十二烷基硫酸钠(SDS)，95℃处理10 min，即为所提取蛋白，采取二喹啉甲酸(BCA)法检测所提取的蛋白浓度。

1.2.6Western印迹检测蛋白表达 分别取50 μg蛋白样品，按4∶1加入5倍(SDS )上样缓冲液，混匀后100℃煮沸5 min制备蛋白样品。配置蛋白胶，蛋白胶凝固后将蛋白样品完全加入蛋白凝胶孔中。80 V电泳30 min，待蛋白进入分离胶后电压调至120 V继续电泳，直至溴酚蓝跑出蛋白凝胶。取出蛋白胶冰浴条件下转膜，转膜完成后，取出聚偏氟丙烯(PVDF)膜，使用5%脱脂奶粉封闭3 h，分别加入Iba-1(1∶1 000)、GFAP(1∶800)、PKA(1∶500)、p-PKA(1∶1 000)、CREB(1∶500)、p-CREB(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)一抗4℃轻轻震荡孵育过夜，Tris盐酸缓冲液(TBST)清洗后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)，常温轻轻震荡孵育1 h，TBST清洗后，加入化学发光试剂，置于Quantity One图像分析系统中成像。

1.3统计学方法 应用SPSS21.0统计学分析软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1苦参碱对AD大鼠认知功能的影响 与假手术组相比，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，第2天开始显著高于假手术组(P<0.01)；与模型组相比，苦参碱组明显缩短，自第3天开始显著低于模型组(P<0.01)。空间探索实验结果显示，模型组大鼠90 s内穿过平台的次数〔(1.91±0.95)次〕显著低于假手术组〔(5.29±1.12)次〕(P<0.01)，与模型组相比，苦参碱组次数〔(3.17±1.29)次〕明显增多(P<0.01)。苦参碱组与假手术组各检测结果无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.2苦参碱对AD大鼠胶质细胞活化的影响 与假手术组相比，模型组Iba-1、GFAP蛋白表达显著增强(P<0.01)；与模型组相比，苦参碱组均明显降低(P<0.01)；苦参碱组与假手术组相比两种蛋白表达无明显差异(P>0.05)。见表2，图1。

2.3苦参碱对AD大鼠血清及海马组织炎症相关因子表达的影响 与假手术组相比，模型组大鼠血清及海马组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均明显升高(P<0.01)；与模型组相比，苦参碱组均显著降低(P<0.01)，苦参碱组与假手术组炎症因子的表达无明显差异(P>0.05)。见表3。

表1 各组大鼠逃避潜伏期比较(±s，s，n=6)

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；下表同

图1 Western印迹检测大鼠海马Iba-1、GFAP蛋白表达

组别Iba⁃1GFAP假手术组0215±00260298±0036模型组0510±00911)0562±00731)苦参碱组0363±00192)0338±00262)

表3 各组大鼠血清及海马组织中炎症因子含量比较(±s，μg/L，n=6)

2.4苦参碱对AD大鼠海马组织PKA/CREB通路蛋白表达的影响 三组大鼠海马组织中PKA、CREB蛋白表达未出现显著性变化(P>0.05)，模型组p-PKA和p-CREB的表达显著低于假手术组(P<0.01)；与模型组相比，苦参碱组p-PKA和p-CREB表达明显升高(P<0.01)；苦参碱组与假手术组相比，PKA及CREB蛋白磷酸化无明显差异(P>0.05)。见表4，图2。

表4 大鼠海马组织PKA/CREB通路蛋白相对表达分析(±s，n=6)

图2 Western印迹检测大鼠海马组织PKA/CREB通路蛋白表达

3 讨 论

AD临床上是以记忆减退、认知障碍及人格改变为主要特征的中枢神经退行性疾病，研究发现AD发病与Aβ在脑内的沉积密切相关，Aβ沉积激活炎症修复机制导致脑部慢性炎症损伤，可能是AD的发病原因〔7〕。Aβ主要包括Aβ1～40和Aβ1～42蛋白，Aβ蛋白在AD患者脑内主要以Aβ1～42形式存在，Aβ1～42在细胞外沉积后，能持续激活脑内炎症反应，诱导大量的炎症因子产生〔8〕。实验证明，海马区注射Aβ1～42能更有效建立AD模型〔9〕。本研究通过向大鼠脑部海马区注射Aβ1～42成功制备了AD大鼠模型。

苦参碱是苦参、苦豆子、山豆根等豆科植物的活性成分，具有清热解毒、抗感染、免疫调节等功效。有研究证明苦参碱对麻醉小鼠脑膜血管具有扩张作用，加快局部血流量；其还能明显抑制脑缺血大鼠环氧化酶(COX)-2的过度表达及胶质细胞的活化，抑制脑部炎症反应〔10〕。本实验结果说明苦参碱能显著改善AD大鼠的学习和记忆功能。

AD发病过程中的神经炎症过程与脑内小胶质细胞和星形胶质细胞的活化有关〔11，12〕。小胶质细胞是一种免疫细胞，致炎因素刺激后活化并分泌IL-6、TNF-α等炎症因子，星形胶质细胞受到外界刺激后活化，进而诱导产生大量的炎症介质，如IL-1β、IL-6、TNF-α等〔13〕。这些细胞因子反过来进一步激活小胶质细胞及星形胶质细胞，进一步刺激炎症因子的分泌，最终导致神经元病变坏死〔14〕，病人出现痴呆等症状。Iba-1是小胶质细胞特异标记蛋白，GFAP是星形胶质细胞特异标记蛋白〔15〕，本研究结果利用放射免疫检测各组大鼠血清及海马组织中炎症因子的含量，结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠血清及海马组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均明显升高，与模型组相比，苦参碱组三种炎症因子的含量显著降低，苦参碱组与假手术组炎症因子的表达无明显差异。说明苦参碱能抑制AD大鼠胶质细胞的活化，抑制炎症的发生。

cAMP是机体内重要的第二信使，通过PKA调节CREB的磷酸化，p-CREB抑制炎症因子表达相关的CRE转录因子的活性，抑制炎症的发生〔16〕；活化PKA/CREB信号通路还能调节下游与神经保护相关蛋白的表达，从而起到保护神经的作用〔17〕。本研究结果说明苦参碱能活化AD大鼠PKA/CREB信号通路。

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〔2017-03-16修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

王 昉(1980-)，女，主治医师，主要从事精神科研究。

吕 路(1978-)，男，主治医师，主要从事精神科研究。

R965

A

1005-9202(2017)16-3931-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.010

1 武汉市中医医院精神科