小鼠食管癌前病变组织P53表达及化浊润燥降气方的干预作用

范焕芳 黄 茂 单保恩 王 玲 韩长辉

(河北省中医院肿瘤二科，河北 石家庄 050011)

小鼠食管癌前病变组织P53表达及化浊润燥降气方的干预作用

范焕芳 黄 茂1单保恩2王 玲2韩长辉

(河北省中医院肿瘤二科，河北 石家庄 050011)

目的观察小鼠食管癌前病变组织P53的表达及中药复方化浊润燥降气方的干预作用。方法将130只小鼠分为正常组、模型组、阳性对照组、中药预防组、中药治疗组，采用4-硝基喹啉-氧化物(4-NQO)制备小鼠食管癌前病变模型，采用流式细胞检测、免疫组织化学方法观察各组食管组织中P53的表达。结果14 w末食管癌前病变模型成功。流式细胞检测：模型组小鼠P53表达水平与正常组相比明显升高(P<0.05)；阳性对照组、中药预防组、中药治疗组P53较模型组明显降低(P<0.05)；中药预防组与阳性对照组P53表达无明显差异(P>0.05)；中药预防组P53表达明显低于中药治疗组(P<0.05)。免疫组织化学检测示阳性对照组与模型组P53表达无明显差异(P>0.05)；中药预防组、中药治疗组分别与模型组及阳性对照组明显降低(P<0.05)；中药预防组低于中药治疗组(P<0.05)。结论小鼠食管癌前病变组织存在P53高表达。化浊润燥降气方能降低食管癌前病变小鼠P53的表达。

食管癌前病变；化浊润燥降气方；4-硝基喹啉-氧化物；P53

我国是食管癌高发国家，发病率为22.14/10万，居各类恶性肿瘤第5位，死亡率为16.77/10万，居第4位〔1〕，5年总生存率低于20%〔2〕。食管中度和重度不典型增生是食管癌变过程中的必经阶段，逆转食管癌前病变向正常细胞分化具有重要意义。P53是与人类肿瘤相关性最高的基因。本文观察小鼠食管癌前病变组织P53的表达及化浊润燥降气方的干预作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取清洁级健康SPF级C57BL/6小鼠130只，雌雄各半，4周龄，体重17～20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.2药物制备：造模药物4-硝基喹啉一氧化物(4-NQO)购自Sigma公司。将1 g 4-NQO溶于50 ml蒸馏水，配成浓度为2%的稀释液，4℃冰箱避光保存。使用时取0.5 ml 2%原液加入100 ml饮用水中，配成100 μg/ml浓度。每100 g小鼠每日用4-NQO 2 500 μg，即口服25 ml含有4-NQO的饮用水。阳性对照组药物全反式维甲酸(ATRA)(购自Sigma 公司)。使用时将30 mg ATRA 溶于20 ml稀释后的甲基纤维素中，每20 g小鼠每次灌胃剂量为0.15 mg，每周3次。化浊润燥降气方：组成：丹参、沙参、郁金、砂仁、荷叶、茯苓、浙贝母、藿香、佩兰、冬凌草、全蝎。由河北省中医院药学部提供，每付中药生药含量131 g，免煎颗粒为13.7 g，小鼠用量与人用量的比例为0.002 6∶1，每20 g小鼠服用0.2 ml含有中药的水溶液。

1.3主要试剂及仪器 兔抗P53多克隆抗体(Santa Cruz公司)；免疫组织化学试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂(北京中杉金桥生物有限公司)；Epics-XLⅡ型流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)。

1.4分组及模型制备 采用随机分组的方法将130只小鼠分为正常组、模型组、阳性对照组、中药预防组、中药治疗组，正常组、阳性对照组各20只，其余每组30只。各组雌雄小鼠数目无明显差异，雌雄分笼。正常组常规饲养，不做特殊处理。其余110只小鼠，每日饮用100 μg/ml的4-NQO水溶液，正常喂养饲料。中药预防组在开始造模同时给予化浊润燥降气方灌胃，每周3次，剂量为20 g小鼠服用0.2 ml浓缩中药免煎颗粒。各组小鼠在给药期间每周测体重一次，根据体重调整给药剂量。14 w末癌前病变模型成功，小鼠停用4-NQO水溶液。之后模型组常规饲养；阳性对照组小鼠开始给予ATRA，剂量为每20 g每次灌胃剂量为0.15 mg，每周3次；中药预防组小鼠继续给予化浊润燥降气方灌胃，剂量如前；中药治疗组小鼠在模型制备成功时开始给予化浊润燥降气方灌胃，用量同预防组。24 w末模型组5只小鼠食管上皮均有癌变，全部处死小鼠，取食管标本，进行各组指标检测。

1.5流式细胞术测定各组小鼠P53的表达 制备单细胞悬液，取单细胞悬液1×106/ml 0.1 ml，加入鼠抗人单克隆抗体工作液 0.1 ml，室温孵育30 min，加入磷酸盐缓冲液(PBS)10 ml洗涤一次，弃上清，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光、室温孵育30 min，加入PBS 10 ml离心同上，弃上清以除去未结合的荧光二抗，上机检测前加入PBS 0.1 ml经500目铜网过滤后上机检测。以x-mode值作为统计量。

1.6免疫组织化学 免疫组织化学SP法检测食管上皮组织P53蛋白表达。将食管组织脱蜡和水化，PBS冲洗，滴加一抗，滴加生物素二抗工作液，滴加辣根过氧化物酶-链霉卵白素工作液，室温孵育30 min。DAB显色：蒸馏水洗，苏木素复染；透明；中性树脂50 μl封片，室温保存。采用HMIAS-2000高清晰度彩色分析系统。每组选6张切片，每张切片测10个区域，对每个区域进行平均光度值测定。

1.7统计学方法 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1流式细胞术检测各组食管上皮组织P53表达变化 正常组P53 x-mode值为(4.23±0.55)；模型组(25.43±2.94)较正常组明显升高(P<0.05)；阳性对照组、中药预防组、中药治疗组P53表达水平分别为(8.85±1.76)、(7.23±0.72)、(11.40±2.03)，三组均较模型组明显降低(P<0.05)；中药预防组与阳性对照组无明显差异(P>0.05)；中药预防组明显低于中药治疗组(P<0.05)。

2.2免疫组织化学法检测各组小鼠食管上皮组织中p53蛋白表达变化 P53蛋白主要表达于细胞核和细胞质，其细胞核及细胞质出现黄色颗粒为阳性。正常组P53的平均光度为(0.136±0.015)；模型组(0.208±0.012)较正常组明显升高(P<0.05)；阳性对照组、中药预防组、中药治疗组分别为(0.202±0.021)、(0.171±0.008)、(0.193±0.018)，阳性对照组与模型组无明显差异(P>0.05)；中药预防组、中药治疗组分别较模型组明显降低(P<0.05)；中药预防组、中药治疗组较阳性对照组明显降低(P<0.05)；中药预防组显著低于中药治疗组(P<0.05)，见图1。

图1 免疫组织化学法检测小鼠食管上皮组织P53表达(DAB，×400)

3 讨 论

研究表明，食管癌发生与亚硝胺类化合物、吸烟、饮酒、真菌、病毒等外界环境因素影响有关，但更主要的是与其本身的基因改变相关〔3〕。野生型P53基因是人体内功能最强大的抑癌基因，它对细胞周期和凋亡起关键性作用。P53基因能够阻断一种血管生成基因的表达，抑制肿瘤内部血管形成，有效防止肿瘤的复发、转移并提高人体自身的免疫功能。另外，P53基因还有修复受损基因的作用。基因受损时P53连接DNA，然后由蛋白质群合力修复受损DNA。如果DNA损伤过度无法修复，P53基因就会诱导细胞进入凋亡状态。P53基因作为一个重要的抗癌基因调控DNA修复、细胞周期停滞和诱导细胞凋亡，维持基因组和细胞稳定，使癌细胞自杀，防止癌变〔4〕。但是一旦该基因发生突变，导致细胞无节制的分裂，就容易引发癌症。

黄志军〔5〕探讨食管癌、癌旁组织中P53、MDR-1基因的表达及相关性，结果表明，突变型P53在食管癌、癌旁组织中均呈高水平表达，P53基因突变早于组织形态学改变。任秀花等〔6〕采用免疫组化方法检测P53蛋白在45例原发性食管鳞癌大体标本中的不同病变区域的表达。结果表明，P53蛋白在食管癌自然病史中呈现渐进性高表达，其在单纯增生和不典型增生中表达有明显性差异，提示P53蛋白基因的改变在食管癌发生的早期就出现了，即发生了基因突变，同时从另一个侧面提示在食管癌前病变阶段观察中药单方或复方的干预作用对于探讨中药的具体作用机制具有重要意义。

食管癌前病变属“噎膈”范畴〔7〕。启膈散具有润燥降气、开郁化痰的作用，可以治疗噎膈轻症患者。化浊润燥降气方是在名方启膈散的基础上加化浊通络解毒之品藿香、 佩兰、冬凌草、天龙、全蝎而成，全方共奏化浊解毒、化痰解郁、通络散结之效。本研究结果表明，食管癌前病变小鼠发展为食管癌时存在P53的高表达，化浊润燥降气方能够抑制P53的表达而阻断食管癌前病变的进展。

1赫 捷,陈万青.中国肿瘤登记年报〔M〕.北京.军事医学科学出版社,2012：28-30.

2Kim T,Grobmyer SR,Smith R,etal.Esophageal cancer:the five year survivors〔J〕.J Surg Oncol,2011;103(2):179-83.

3邰智慧,张 科,李淑英,等.人乳头瘤病毒感染与不同地域食管癌发生相关性Meta 分析〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(18):4451-3.

4贾春平.抑癌基因P53与肿瘤研究的最新进展〔J〕.生命科学,2008;20(3):450-3.

5黄志军.食管癌、癌旁组织中P53、MDR-1 基因的表达〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(7):1782-4.

6任秀花,郭 坤,李珊珊,等.食管癌及癌前病变中p53、CD44v6蛋白的表达及其意义〔J〕.河南肿瘤学杂志,2004;17(3):161-2.

7霍炳杰,徐江红,邢筱华.刘亚娴教授治疗食管癌前病变经验〔J〕.河北中医,2011;33(4):488-9.

〔2016-04-17修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

河北省高层次人才资助项目(No.B2012003007)

单保恩(1962-)，男，主任医师，医学博士，博士生导师，主要从事恶性肿瘤研究。

范焕芳(1970-)，女，主任医师，医学博士，硕士生导师，主要从事恶性肿瘤研究。

R732

A

1005-9202(2017)16-3950-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.018

1 河北省中医院儿童康复科 2 河北医科大学第四医院科研中心