以二抗为基底猪瘟抗体ELISA 检测方法建立

刘丽娅 汪萍 苗书魁[新疆畜牧科学院兽医研究所 （新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心） 830000]

以二抗为基底猪瘟抗体ELISA 检测方法建立

刘丽娅 汪萍 苗书魁*[新疆畜牧科学院兽医研究所 （新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心） 830000]

为验证以鼠抗猪IgG为基底，用辣根过氧化物酶标记猪瘟E2蛋白，建立的猪瘟抗体ELISA检测方法的可行性，对影响ELISA试验结果的主要条件进行优化。结果表明，鼠抗猪IgG最佳包被浓度为1μg/ml，酶标猪瘟E2蛋白最佳稀释度为1：500，最佳封闭液为1%BSA。建立的方法对猪蓝耳病阳性血清、猪圆环病阳性血清、猪亚洲1型口蹄疫阳性血清、猪O型口蹄疫阳性血清均无交叉反应。通过对50份试验样本的检测，对比该方法与商品化IDEXX的猪瘟病毒抗体检测试剂盒的符合性，试验结果表明，该方法检测猪瘟抗体的相对敏感性为76.9% （30/39），相对特异性为90% （45/50）。

二抗；猪瘟；抗体；ELISA方法

猪瘟是流行较早的疫病，在疫病监测与防控中猪瘟病毒抗体ELISA试剂盒发挥着重要作用。目前针对猪瘟病毒抗体的ELISA检测方法有：IDEXX猪瘟抗体试剂盒和荷兰赛迪公司的猪瘟抗体试剂盒检测效果相对较好[1-5]。国内对猪瘟ELISA抗体检测试剂盒的研究一直是热点，中国兽医药品监察所等研制的猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒2016年获批新兽药。本实验采用包被二抗的方法，包被的二抗与猪血清中的IgG抗体结合，第三步将经过酶标记的猪瘟E2蛋白与猪瘟抗体发生抗原抗体结合反应[1]，从而对猪瘟抗体进行检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料

辣根过氧化物酶标记试剂盒购自东仁化学科技 （上海）有限公司，猪瘟E2蛋白由新疆畜牧科学院兽医研究所病毒室自制，包被缓冲液、PBST溶液、酶标终止液均为自配。96孔高亲和力可拆分酶标板，购自从Costar公司；小鼠抗猪二抗购自上海士峰生物；酶标底物TMB购自Promega公司，BSA购自上海百赛生物科技有限公司。

1.2 辣根过氧化物酶标记猪瘟E2蛋白

按试剂盒说明书对猪瘟E2蛋白进行酶标记。

1.3 抗体包被浓度与血清稀释度的选择

将鼠抗猪二抗以1.5μg，1μg，0.5μg包被酶标板，血清稀释为1：2、1：5、1：10，用酶标仪检测各孔OD450值，根据OD450值选择最佳抗体包被浓度及血清最佳稀释度。

1.4 最佳封闭液的选择

封闭液分别为1%BSA、2%马血清、5%脱脂奶粉，用酶标仪检测各孔OD450值，根据OD450值选择最佳封闭液。

1.5 以二抗为基底的猪瘟抗体ELISA诊断方法建立

将100μl的1：2稀释待检血清及阳性、阴性对照血清分别加入已经包被过二抗的96孔酶标板中，用封板膜封板后置37℃温育1h，弃去液体，每孔加300μl的PBST洗涤3～5次，加入100μl的1：500倍稀释HRP-猪瘟E2蛋白，用封板膜封板后置37℃温育1h，弃去液体，每孔加300μl的PBST洗涤3～5次，每孔加入50μl的TMB溶液，15min后每孔加入50μl终止液，用酶标仪读取OD450值。

1.6 结果判定

要使试验有效，需符合下列条件：阳性对照的平均值减去阴性对照的平均值必须大于或等于0.150；此外，阴性对照的平均值必须小于或等于0.150。结果计算方法：阳性对照平均值阴性对照平均值样本的计算结果判定：CSFV抗体的有无是通过计算每个样品的S/P值判定。如果S/P值低于0.40，样品应判为CSFV抗体阴性。如果S/P值大于或等于0.40，样品应判定为CSFV抗体阳性。

1.7 对其他猪病血清的交叉反应

将猪蓝耳病阳性血清、猪圆环病阳性血清、猪亚洲1型口蹄疫阳性血清、猪O型口蹄疫阳性血清，检测有无血清交叉反应。

1.8 与商品化试剂盒对比的符合性试验

通过检测样本的阳性数量与阴性数量的关系判定与IDEXX试剂盒的相对特异性及相对敏感性。

2 结果

2.1 抗体包被浓度与血清稀释度的选择

通过正交试验进行9次不同组合的筛选，最终确定二抗最佳包被浓度为1μg/ml，待检血清最佳稀释度为1：2，见表1。

2.2 最佳封闭液

选择1%BSA、2%马血清、5%脱脂奶粉为封闭液，通过对不同稀释度的阳性血清、阴性血清进行检测，根据OD450值确定1%BSA为最佳封闭液，见表2。

2.3 对其他猪病血清的交叉反应

检测该方法对猪蓝耳病阳性血清、猪圆环病阳性血清、猪亚洲1型口蹄疫阳性血清、猪O型口蹄疫阳性血清有无交叉反应，检测结果均为阴性，见表3。

2.4 与商品化试剂盒对比的符合性试验

通过对50份试验样本的检测，对比该方法与商品化IDEXX的猪瘟病毒抗体检测试剂盒的符合性，该方法检测猪瘟抗体的相对敏感性为76.9% （30/39），相对特异性为90%（45/50）， 见表 4。

3 讨论

本试验使用HRP标记试剂盒对猪瘟E2蛋白进行标记，通过对二抗包被、血清稀释度、酶标抗原稀释度等主要参数的筛选，建立以二抗为基底的猪瘟抗体ELISA诊断方法。该方法的优势在于可以通过增加酶标抗原，完成两种针对性抗体的检测。使用者可以根据需求对样品进行随机检测，可分别检测两种标记抗原的抗体，也可只选择其中任意一种标记抗原进行对应抗体的检测，降低使用成本。

本方法对试验标准阳性及阴性对照血清的检测效果良好，通过临床试验样品检测证实该方法的相对敏感性为76.9% （30/39）， 相对特异性为90% （45/50）。 该方法的敏感性不高，分析原因与自然条件下猪感染的疾病较复杂，接触的病原更具多样性，包括细菌、病毒、寄生虫等，产生的针对性抗体会与猪瘟抗体竞争结合于二抗，从而使该方法对临床样本的敏感性降低。

表1 不同浓度二抗、不同血清稀释度CSFV抗体检测结果

表2 不同封闭液CSFV抗体的检测结果

表3 几种阳性血清的交叉性试验

表4 两种检测方法的符合率试验

参考文献：

[1]吴秀娟,李凯航,杨显超,等.猪瘟病毒5种ELISA抗体检测试剂盒的比较[J].中国动物检疫,2015,32(5)：78-81.

[2]魏海燕,曾静,张伟,等.ELISA检测试剂盒在出入境检验检疫中的应用与质控[J].检验检疫学刊,2015,25(4)：55-57.

[3]李红梅,陈佳,徐斐,等.ELISA测定中TMB显色体系的优化及其稳定性研究[J].生物技术通报,2010(2)：126-130.

[4]张伟,傅溥博,高宏伟,等.ELISA操作注意事项及不确定度分量分析[J].检验检疫学刊,2015,25(4)：52-55.

[5]常娅莉,席仲兴,吴智远,等.鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒的研制[J].中国生物制品学杂志,2013,26(12)：1801-1804.

[6]Mijung J,Byungki C,Young SC.Development of a Quantitative Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for De tecting the MPT64 Antigen of Mycobacterium tuberculosis[J].Yonsei Med J,2014,55(3)：746-752.

刘丽娅 （1984-），女，安徽省阜阳市人，助理研究员，主要从事动物传染病研究。*

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