灵芝孢子粉对癫痫大鼠脑组织线粒体钙和c-Fos的影响

刘 辉

（江苏省南通卫生高等职业技术学校护理系，江苏 南通 226001）

灵芝孢子粉对癫痫大鼠脑组织线粒体钙和c-Fos的影响

刘 辉

（江苏省南通卫生高等职业技术学校护理系，江苏 南通 226001）

目的研究灵芝孢子粉对癫痫大鼠脑组织组织线粒体钙和c-Fos的影响。方法对健康雄性Wistar大鼠45只进行建模，随机分成对照组（生理盐水腹腔注射+生理盐水灌胃），模型组（PTZ腹腔注射+生理盐水灌胃），灵芝孢子粉组（PTZ腹腔注射+灵芝孢子粉灌胃），每组各15只，采用火焰原子吸收法测定3组脑组织线粒体Ca2+的水平，免疫组织化学方法检测脑组织c-Fos。结果c-Fos在大鼠皮质区、海马区均可见表达。与对照组和模型组比较，灵芝孢子粉组的c-Fos表达水平明显降低（P＜0.05）；灵芝孢子粉组的线粒体Ca2+水平明显增加（P＜0.05）。结论灵芝孢子粉通过增加线粒体Ca2+水平及抑制c-Fos的表达来减少癫痫发作对脑细胞线粒体所造成的损伤，进而达到抗癫痫的效果。

灵芝孢子粉；癫痫；大鼠；脑组织；线粒体钙；c-Fos

癫痫属于一种比较常见的神经系统疾病，此病对患者的生存质量危害比较大[1]。目前，治疗癫痫的药物比较多，但是效果不尽相同[2-3]。同时，一些新的抗癫痫药物也随着药物学的发展而不断出现，虽然在抗癫痫方面获得了突破性进展，但是对于难治性癫痫尚是一大顽疾，有待新的治疗此类难治性癫痫的药物的出现。灵芝孢子粉是近年来人们比较关注的一类药物[4]，但是关于其在抗癫痫过程中的作用机制尚不是很明确。本研究着重探讨灵芝孢子粉对癫痫大鼠脑组织组织线粒体钙和c-Fos的影响，以揭示灵芝孢子粉在抗癫痫中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料。灵芝孢子粉：购自山东云海灵芝专业合作社；戊四氮（PTZ）：购自上海博顿生物化工有限公司；兔抗大鼠c-Fos多克隆抗体：购自武汉博士德生物工程有限公司。DAB显色试剂盒：购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 实验动物分组：健康雄性Wistar大鼠36只，体质量152～234 g，普通级动物，由某医科大学动物实验中心提供。实验过程中大鼠的处置符合动物伦理学标准。依据体质量把45只大鼠随机分成3组：分成对照组（生理盐水腹腔注射+生理盐水灌胃），模型组（PTZ腹腔注射+生理盐水灌胃），灵芝孢子粉组（PTZ腹腔注射+灵芝孢子粉灌胃），每组各15只。

1.3 脑组织细胞线粒体钙测定：将3组大鼠运用断头低温快速取出大脑，脑膜给予剔除干净之后，运用蔗糖-Tris缓冲液及玻璃匀浆器把脑组织制作成匀浆，实施差速离心，获得线粒体沉淀物，收集线粒体悬液在阴暗处进行硝化1周。使用原子火焰吸收分光计对线粒体钙吸光度进行测定。

1.4 脑组织c-Fos的测定：将3组大鼠麻醉后进行断头处死操作，低温下快速取脑，并分离出海马组织，运用中性甲醛溶液对其行24 h以上的固定操作，接着采用PBS水给予冲洗5次，使用酒精梯度实施脱水之后，运用石蜡进行包埋大脑皮质和海马组织，采用锡纸包裹好之后置入冰箱中用于脑组织c-Fos的检测。

使用免疫组织化学方法测定各组大鼠大脑皮质和海马组织中的c-Fos水平，操作步骤分别严格按照兔抗大鼠c-Fos试剂盒说明书操作。染色切片在BI-2000医学图像分析系统显微镜下观察，呈棕黄色颗粒者为阳性。每张切片观察10个有代表性的视野，并计数每一个视野的阳性细胞数以检测c-Fos的表达情况。

1.5 统计学处理：应用SPSS 20.0统计分析软件包进行统计分析。计量资料采用表示，组间比较采用t分析，计数资料采用χ2分析，均以α=0.05作为检验水准，P＜0.05具有统计学差异。

2 结 果

2.1 各组大脑组织织线粒体Ca2+比较：与对照组和模型组比较，灵芝孢子粉组的织线粒体Ca2+含量明显增加（P＜0.05），见表1。

表1 各组大脑组织织线粒体Ca2+比较（μg/mL，

表1 各组大脑组织织线粒体Ca2+比较（μg/mL，

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，aP＜0.05

组别n皮质区海马区对照组155.57±0.849.64±1.73模型组157.14±1.23*11.16±2.56*灵芝孢子粉组159.43±2.05*a18.82±3.41*a

2.2 各组大脑组织c-Fos表达水平比较：与对照组和模型组比较，灵芝孢子粉组的c-Fos表达水平明显减少（P＜0.05），见表2。c-Fos表在大鼠皮质区的表达见图1～2；c-Fos表在大鼠海马区的表达见图2。

表2 各组大脑组织c-Fos表达水平比较（个/视野，

表2 各组大脑组织c-Fos表达水平比较（个/视野，

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，aP＜0.05

组别n皮质区海马区对照组1525.34±2.1421.15±5.37模型组1563.57±4.27*43.56±9.64*灵芝孢子粉组15124.35±5.16*a86.24±10.35*a

3 讨 论

一般情况下，Ca2+对神经细胞膜兴奋性具有稳定及维持的作用，如果血液中的Ca2+水平减少，则神经细胞膜电位就会出现不稳定，进而激发癫痫的发作，产生异常放电[5-7]。因此，Ca2+水平发生失衡为癫痫发病的一个可能机制。本研究显示，与对照组和模型组比较，灵芝孢子粉组的线粒体Ca2+水平明显增加（P＜0.05）。说明，灵芝孢子粉可以调节Ca2+含量而对神经元起到一定的保护作用。

相关研究表明[8-9]，癫痫发作时c-Fos会发生改变。由此可见，c-Fos在一定程度上可以反映出神经元之兴奋状态，通过c-Fos的影响因素进行干预，能够调节c-Fos的表达，使之上调或者下调[10]。本研究显示，c-Fos在大鼠皮质区、海马区均可见表达。与对照组和模型组比较，灵芝孢子粉组的c-Fos表达水平明显降低（P＜0.05）。说明，灵芝孢子粉是通过减少脑内c-fos基因表达的途径来起到抗癫痫的效果。

图1 c-Fos表在大鼠皮质区的表达（DAB，×200）

图2 c-Fos表在大鼠海马区的表达（DAB，x200）

综上所述，灵芝孢子粉通过增加线粒体Ca2+水平及抑制c-Fos的表达来减少癫痫发作对脑细胞线粒体所造成的损伤，进而发挥抗癫痫的作用。

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[10] 赵璐,王淑秋,王喆.灵芝孢子粉对戊四氮致痫大鼠脑组织GDNF与NT-3表达的影响[J].中国病理生理杂志,2010,26(4):812-815.

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1671-8194（2017）22-0051-02

江苏省卫生科研项目JZ201319