GSDMB/ORMDL3基因CpG序列多态性与中国汉族人哮喘相关的临床研究

袁亚平++吴浩++杨华++顾文超

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.16.101

[摘要] 目的 分析漢族人GSDMB/ORMDL3基因CpG序列[胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鸟嘌呤（G）]单核苷酸多态性位点（SNP）与支气管哮喘的相关性。 方法 运用SNaPshot技术检测哮喘患者（2014年1月—2016年1月在上海市浦东新区人民医院呼吸科就诊的支气管哮喘患者（n=170例）和健康人（n=172例）GSDMB/OMDL3基因CpG序列的3个SNP位点，rs7216389、rs4065275和rs12603332，比较组间基因型和等位基因频率的差异。结果 GSDMB基因rs7216389存在C-T多态性，ORMDL3基因rs4065275存在A-G多态性，ORMDL3基因rs12603332存在T-C多态性。Rs7216389 TT TC CC基因型在哮喘组频率分别为59.4%、36.5%、4.1%，对照组45.9%、41.9%、12.2%，T C等位基因在哮喘组频率分别为77.6%、22.4%，对照组66.9%、33.1%。Rs4065275 GG GA AA基因型在哮喘组频率分别为57.1%、32.4%、10.6%，对照组41.9%、38.4%、19.8%，G A等位基因在哮喘组频率分别为73.2%、26.8%，对照组61.0%、9.0%。Rs12603332 CC CT TT基因型在哮喘组频率分别为61.2%、34.1%、4.7%，对照组50.6%、38.4%、11.0%，C T等位基因在哮喘组频率分别为78.2%、21.8%，对照组69.8%、30.2%。这3个SNP位点基因型和等位基因频率在哮喘组和对照组的差异有统计学意义（P<0.05）。结论 Rs7216389C-T，rs4065275A-G， rs12603332T-C位点变异与中国汉族人哮喘明显相关。

[关键词] GSDMB/OMDL3；单核苷酸多态性；支气管哮喘

[中图分类号] R562.25 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）06（a）-0101-04

Risk of Asthma is Associated with CpG-site Polymorphisms at the GSDMB/ORMDL3 Among Han Population in China

YUAN Ya-ping， WU Hao，YANG Hua，GU Wen-chao

Department of Respiratory Medicine，People's Hospital of Shanghai Pudong District， Shanghai，201200China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between CpG-site polymorphisms at the GSDMB/ORMDL3 with allergic asthma in a population of Hans in China. Methods A tota of 170 asthmapatients were recruitedfrom January 2014 to January 2016 in People's Hospital of Shanghai Pudong Districtand 172 healthy controls recruited from Hans population in china were genotyped to detect CpG-site single nucleotide polymorphism（SNP） of GSDMB/ORMDL 3 genes（rs7216389，rs4065275 and rs12603332） using SNaPshot technology. Results There was SNPs in GSDMB gene rs7216389 C-T， ORMDL3 geners4065275 A-Gand rs12603332T-C.Rs7216389 TT TC CC genotype frequency in asthma were 59.4%，36.5%，4.1%.in control were 45.9%，41.9%，12.2%.T C allele frequency in asthma were 77.6%，22.4%.in control were 66.9%，33.1%.Rs4065275 GG GA AA genotype frequency in asthma were57.1%，32.4%，10.6%.in control were41.9%，38.4%，19.8%.G A allele frequency in asthma were 73.2%，26.8%.in control were 61.0%，39.0%.Rs12603332 CC CT TT genotype frequency in asthma were61.2%，34.1%，4.7%.in control were50.6%，38.4%，11.0%.C T allele frequency in asthma were78.2%，21.8%.in control were69.8%，30.2%.Genotype frequency and allele frequency of the three SNPs were significantly different （P<0.05） in asthma group compared with control group. Conclusion Our results show that rs7216389C-T，rs4794820 A-G and 12603332T-C variations are associated with higher asthma risk among Han population in China.endprint

[Key words] GSDMB/ORMDL3； Single nucleotide polymorphism （SNP）； Asthma

支气管哮喘是一种有家族聚集倾向的多基因遗传病，采用病例对照设计的全基因组关联研究（GWAS）[1，2]，发现哮喘相关的基因位于染色体17q21，包含GSDMB基因（gasdermin家族成员之一）和ORMDL3基因（ORMDL sphingolipid biosynthesis regulator 3）。Rs7216389 （C/T），rs4065275 （A/G） 和 rs12603332 （T/C）是位于GSDMB/ORMDL3基因CpG序列（胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鸟嘌呤（G）的缩写）的单核苷酸多态性位点（single nucleotide polymorphism SNP）已经证实与哮喘相关[3]，Rs7216389位于GSDMB基因，rs4065275 和 rs12603332位于ORMDL3基因。该研究选择2014年1月—2016年1月在上海市浦东新区人民确诊的哮喘患者170例，分析这3个SNP与汉族人群哮喘的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

哮喘组：选自2014年1月—2016年1月在上海市浦东新区人民医院就诊的支气管哮喘患者，共170例，年龄18～70岁，平均年龄37岁；其中男性87例，女性83例，支气管哮喘诊断符合《支气管哮喘防治指南》[4]。对照组：上海地区172名健康体检者，年龄28～70岁，平均年龄41岁，其中男性89名，女性83名，无哮喘和过敏性疾病史及相关家族史，肺通气功能正常。所有患者与对照组年龄相匹配，均为无亲缘关系的汉族人，组间差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2实验方法

血标本采集与DNA制备采集静脉血2 mL用乙二胺四乙酸二钾抗凝，分离血浆。剩余血细胞抽取白细胞基因组DNA（采用基因组DNA提取试剂盒 promega），按说明书操作。DNA溶于50uLTE缓冲液，稀释为100 ng/uL，-20℃保存。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）从基因组数据库网站获取rs7216389、rs4065275和rs12603332位点的序列，设计引物，引物序列见表1， 引物由上海生工生物工程公司合成，稀释为20 pmol/μL使用。PCR反应体系共15 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，2×Taq MasterMix7.5 μL，0.5 μmol/L， 用灭菌双蒸水补充至15 μL。扩增循环参数： 94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30s， 55℃退火30s， 72℃延伸30s，共35个循环。1%琼脂糖凝胶电泳，片段条带大小正确后，PCR扩增产物纯化好置-20℃冰箱冻存用于基因分型。

基因分型应用单碱基延伸（SNaPshot）法进行基因分析。取纯化后的PCR产物1 μL，分别取rs7216389、rs4065275和rs12603332位点的序列引物各0.2 μL，SNPshot@RMultiplex试剂1 μL，用灭菌双蒸水补足至5 μL。PCR循环条件：95℃预变性1 min；95℃变性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸30 s，共进行25个循环。ABI3730 DNA Analyzer（48）型遗传分析仪上机检测基因型。用Gene mapper 5.0（ABI）軟件读取结果。

1.3 统计方法

采用SPSS19.0统计学软件对数据统计分析，χ2检验比较组间基因型及等位基因频率。基因型和等位基因的离散程度采用哈迪温伯格平衡分析（ Hardy-Weinberg equilibrium，HWE），比值比（OR）和95%可信区间（95%CI）确定相对危险度，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

Rs7216389， rs4065275，rs12603332的基因型和等位基因频率见表2。rs7216389-TT，rs4065275-GG，rs12603332-CC在哮喘组明显增高，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。哮喘患者等位基因rs7216389-T，rs4065275-G，rs12603332-C与对照组比较，明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。哮喘组和对照组基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡（P>0.05）。

3 讨论

该研究通过对170例哮喘-172例对照研究，显示GSDMB/ORMDL3基因CpG序列rs7216389，rs4065275和rs12603332位点变异与汉族人哮喘相关。本研究中，哮喘患者rs7216389TT基因型频率59.4%，较健康人45.9%明显增高，T等位基因频率在哮喘组77.6%，较健康人66.9%明显增高，胡慧婷等[5]研究显示中国南方汉族人哮喘患者rs7216389 TT频率67.4%，T频率82.0%，均较健康人明显增高，与本研究接近，且发现吸烟患者rs7216389TT明显高于非吸烟组。Zihlif M[6]等研究亦显示哮喘儿童rs7216389SNP位点T明显增高。GSDMB基因是gasdermin家族成员之一，在促进或维持上皮细胞的终末分化状态中具有重要作用[7]。ORMDL3基因编码位于内质网上的血清类粘蛋白1样蛋白3，可以通过抑制钙泵的活性导致内质网钙平衡失调，进而引发内质网应激，从而导致未折叠蛋白反应进而成为炎症发生的内源性诱因。哮喘患者中，rs7216389与外周血淋巴细胞ORMDL3 mRNA水平相关，提示其不仅调控GSDMB，而且调控ORDML3基因的表达[1]。Rs4065275GG基因型频率在哮喘组57.1%，较对照组41.9%明显增高，G在哮喘组73.2%，较对照组61.0%明显增高。一项多中心研究显示[8]，rs4065275G等位基因在哮喘患儿明显增高，且体外研究显示，rs4065275位点A突变为G导致单核细胞白介素4和白介素13释放增加，这可能是rs4065275变异影响哮喘的机制之一。Rs12603332CC基因频率在本研究中哮喘组61.2%，较对照组50.6%明显增高，C在哮喘组78.2%，较对照组69.8%明显增高，王冰洁等[9]研究哮喘患儿rs12603332CC基因型频率57.0%，C等位基因频率75.0%，且发现哮喘患儿CC基因型血清Lyso-PC和apoB水平明显增高，提示血清中Lyso-PC和apoB水平可能与哮喘易感基因ORMDL3 rs12603332位点共同作用导致儿童哮喘的发生。endprint

CpG是胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鸟嘌呤（G）的缩写，基因组中长度300-3000bp的富含CpG二核苷酸的一些区域，称为CpG岛，主要存在于基因的5区域，启动子区中CpG岛的未甲基化状态是基因转录所必需的，CpG序列中C的甲基化可导致转录被抑制。CpG位点的单个核苷酸多态性与CpG的甲基化相关[10]，CpG序列甲基化影响mRNA转录。研究显示[3]，rs72l6389-T位于GSDMB基因第一个内含子的CpG序列，突变减少了一个CpG，该位点的DNA序列是非甲基化的，但和ORMDL3基因的5-甲基胞嘧啶CpG岛的甲基化相关。Rs4065275-G在ORMDL3基因的5-甲基胞嘧啶的CpG区，突变产生了一个CpG，该位点DNA甲基化的频率明显增高达52.9%，且周围CpG区的甲基化亦明显增高，而rs4065275-AA的序列是非甲基化。rs12603332-C位于ORMDL3基因CpG島的附近，突变生成了一个CpG，该位点的DNA序列仅有2.88%甲基化，rs12603332-TT均非甲基化，但其周围的CpG序列甲基化频率增高，具体原理尚不明确。该研究显示携带rs7216389-TT （GSDMB）， rs4065275-GG and rs12603332-CC（ORMDL3） 的儿童，外周血淋巴细胞中GSDMB和ORMDL3基因的mRNA明显增高，同时还显示DNA甲基化和ORMDL3基因mRNA水平相关，因此假设这三个CpG序列的单核苷酸多态性，导致DNA序列的甲基化，从而增加GSDMB和ORMDL3基因的mRNA转录。

该研究显示在哮喘患者中，rs7216389-TT，rs4065275-GG，rs12603332-CC明显增高，既往研究提示可能和CpG序列的甲基化有关，但具体机制尚不明确，期待进一步研究。

[参考文献]

[1] Moffatt MF，Kabesch M，Liang L，et a1.Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma[J].Nature，2007，448（7152）：470-473.

[2] Nieuwenhuis MA，Siedlinski M，van den BM，et al.Combining genomewide association study and lung eQTL analysis provides evidence for novel genes associated with asthma[J].Allergy，2016，71（12）：1712-1720.

[3] Nathalie A， Lovisa E， Reinius D，et al. Risk of childhood asthma is associated with CpG-site polymorphisms， regional DNA methylation and mRNA levels at the GSDMB/ORMDL3 locus[J]. Human Molecular Genetics， 2015， 24（3）： 875-890.

[4] 中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.中国支气管哮喘防治指南（2016年版）[J].中华结核和呼吸杂志，2016，39（9）： 675-697.

[5] 胡慧婷，杨帆，汪亚君，等.中国南方汉族人群哮喘与GSDMB/ORMDL3基因多态性[J]中国公共卫生，2016 ，32（4）：502-506.

[6] Zihlif M，Obeidat NM，Zihlif N，et al.Association Between Gasdermin A and Gasdermin B Polymorphisms and Susceptibility to Adult and Childhood？Asthma？Among Jordanians[J].Genet Test MolBiomarkers，2016，20（3）：143-148.

[7] 王建军，王大军，王乐.GSDMB和ZPBP2基因单核苷酸多态性与宁夏汉族人群系统性红斑狼疮的相关性研究[J].宁夏医学杂志，2014，36（11）：991-993.

[8] Michaela S，Sven M，Vincent D.G，et al.Polymorphisms related to ORMDL3 are associated withasthma susceptibility， alterations in transcriptionalregulation of ORMDL3， and changes in TH2 cytokine levels[J].The Journal of Allergy and Clinical Immunology， 2015， 136（4）：893-903.

[9] 王冰洁，王桂兰，陈德晖等，哮喘患儿ORMDL3基因多态性与溶血卵磷脂及载脂蛋白B的关系[J].中国当代儿科杂志，2015，17（3）：241-244.

[10] Liu Y，Aryee MJ，Padyukov L，et al. Epigenome-wide association data implicate DNA methylation as anintermediary of genetic risk in rheumatoid arthritis. Nature Biotechnology，2013，31：142-147.

（收稿日期：2017-03-08）endprint