长白山榛仁蛋白水解物的制备工艺研究

王明爽，徐晶

（1.通化师范学院长白山食用植物资源开发工程中心，吉林通化134002；2．通化师范学院制药与食品科学学院，吉林通化134002）

长白山榛仁蛋白水解物的制备工艺研究

王明爽1，2，徐晶1，2

（1.通化师范学院长白山食用植物资源开发工程中心，吉林通化134002；2．通化师范学院制药与食品科学学院，吉林通化134002）

以长白山榛仁分离蛋白为原料，用碱性蛋白酶Alcalase水解制备榛仁蛋白水解物，通过对水解过程中的加酶量、pH、温度和底物浓度等因素进行单因素和响应面试验，优化得出榛仁蛋白水解物的最佳水解工艺为：加酶量10 000 U/g，pH8.5，温度53.5℃，底物浓度2.0%，水解时间150 min，在此条件下制备的榛仁蛋白水解物的水解度达39.72%。

长白山榛仁；蛋白水解物；响应面

榛子（Corylus heterophylla Fisch.），为桦木科榛属植物，在世界范围内有约20个榛属品种。作为国际知名的四大坚果之一，野生榛子广泛分布在我国长白山地区，最知名的种类是平榛和毛榛，特别是平榛，更为知名[1-2]。榛仁营养丰富，含脂肪高达57.1%～62.1%，蛋白质达16.2%～21.12%，碳水化合物6.5%～9.3%，还含有维生素C、维生素E和多种矿物质[3]。榛仁粕是榛子榨油后的副产品，富含蛋白质，却被主要用作动物饲料，粕的利用价值低，造成优质蛋白资源的浪费[4]。

据报道，酶水解可以通过将蛋白质转化为具有所需大小、电荷和表面性质的肽从而改善饮食蛋白质的功能性质且不影响其营养价值[5]。近年来，国内外大量研究表明，动物或植物蛋白质经蛋白酶水解后可产生多种具有有益生理活性的物质，如牛奶[6]、乳清[7]、大豆[8]、鱼卵[9-10]等的蛋白质水解物具有免疫调节功能；玉米[11]、花生[12]、大米[13]、菜籽[14]等的蛋白质水解物具有抗氧化活性和ACE抑制活性。

蛋白质的水解是以水解度（DH）衡量的，DH是决定蛋白质水解产物功能性质的重要参数。DH影响肽的大小并因此影响肽的氨基酸组成，受DH影响的氨基酸组成的变化也可以调节水解期间形成的肽的生物活性[5]。本研究以长白山榛仁分离蛋白为原料，以水解度为判定指标，优化长白山榛仁蛋白水解物的制备工艺，以期提高长白山榛子资源的综合利用开发，为长白山野生榛仁水解肽的深入研究提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长白山榛仁分离蛋白（蛋白含量为94.4%）：吉林农业大学食品学院实验室自制；Alcalase 2.4L FG：丹麦诺维信公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

XMTD-8222型水浴锅：精宏仪器公司；BSA224S型分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；ZD-2型自动电位滴定仪：上海仪电科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 榛仁蛋白水解物的制备

将一定质量的榛仁分离蛋白加入100 mL蒸馏水中，配成所需浓度的蛋白溶液，于100℃水浴锅中放置15 min，充分破坏蛋白结构，快速冷却后放入恒温水浴锅中，用0.6 mol/L NaOH溶液调节至所需pH值后，加入一定量的Alcalase，不停地摇晃瓶身以保证水解充分，用自动电位滴定仪滴加NaOH溶液维持pH值恒定，水解一定时间后记录消耗的NaOH溶液体积，计算水解度。

1.3.2 榛仁蛋白水解物制备的单因素试验

选取加酶量、pH值、温度、底物浓度等4个因素作为单因素，分别设置5个水平，考察各因素对榛仁蛋白水解物水解度大小的影响，初步确定各因素的最适水解条件。

1.3.3 榛仁蛋白水解物制备的响应面试验

以单因素试验结果为基础，利用Design Expert 8.0分析软件中的Box-Behnken中心组合试验原理，选取对榛仁蛋白水解物水解度影响较大的因素，即加酶量、pH值、温度，设计三因素三水平的响应面试验，以水解度为响应值，优化榛仁蛋白水解物的水解条件。

1.3.4 水解度（DH）测定

水解度的测定采用pH-stat法进行测定[15]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 加酶量对水解度的影响

在水解pH8.0、温度50℃、底物浓度2.0%、水解时间150 min的条件下，不同加酶量对榛仁蛋白水解物水解度的影响结果见图1。

如图1所示，随着加酶量的增加，Alcalase水解榛仁分离蛋白的水解度呈现上升趋势，当加酶量为8 000 U/g时，水解度为37.72%，继续增大加酶量至10 000 U/g，水解度的增加幅度很小。随着加酶量的增加，水解反应的速度加快，大部分蛋白质在较短时间内被水解为小分子多肽，当蛋白质减少到一定程度时，体系中多余酶的作用底物主要是小分子多肽，体现为反应体系的水解度增幅趋于平缓[16]，因此Alcalase水解榛仁分离蛋白的最适加酶量选择8 000 U/g。

图1 加酶量对水解度的影响Fig.1 Effect of Alcalase volume on degree of hydrolysis

2.1.2 pH对水解度的影响

在加酶量8 000 U/g、水解温度50℃、底物浓度2.0%、水解时间150 min的条件下，不同pH值对榛仁蛋白水解物水解度的影响结果见图2。

图2 pH值对水解度的影响Fig.2 Effect of pH on degree of hydrolysis

碱性蛋白酶Alcalase在偏碱性条件下能够发挥更好的水解作用，由图2可以看出，pH值对榛仁蛋白水解物水解度的影响呈现先升高后降低的趋势，最佳pH值为9.0，水解度达38.10%，因此选择pH9.0作为Alcalase水解榛仁分离蛋白的最适pH值。

2.1.3 温度对水解度的影响

在加酶量8 000 U/g、pH8.5、底物浓度2.0%、水解时间150 min的条件下，不同温度对榛仁蛋白水解物水解度的影响结果见图3。

水解过程中的温度对蛋白酶分子稳定性的影响很大，水解温度过高，会使蛋白酶分子的次级键发生解离，导致蛋白酶失活，水解温度低，则使反应体系的分子运动减慢，蛋白酶与底物的作用几率降低，降低水解反应速度[17]。由图3可以看出，碱性蛋白酶Alcalase水解榛仁分离蛋白的最适水解温度为55℃，水解度达39.58%。

图3 温度对水解度的影响Fig.3 Effect of temperature on degree of hydrolysis

2.1.4 底物浓度对水解度的影响

在加酶量8 000 U/g、pH8.5、水解温度50℃、水解时间150 min的条件下，不同底物浓度对榛仁蛋白水解物水解度的影响结果见图4。

图4 底物浓度对水解度的影响Fig.4 Effect of substrate concentration on degree of hydrolysis

底物浓度过低时，蛋白酶分子与底物的结合几率降低，但底物浓度过高，溶液的粘度增大，影响蛋白酶扩散，抑制水解反应进行[18]。由图4可以看出，底物浓度对榛仁蛋白水解物水解度的影响不是非常明显，但也显示出先增高后降低的趋势，在2.0%时水解度达到最大值，因此选择2.0%作为水解榛仁分离蛋白的最佳底物浓度。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验模型的建立及分析

由于底物浓度的变化对水解度的影响较小，因此在响应面试验中不对此因素进行优化，选取水解pH、温度和加酶量3个因素进行响应面分析。利用Box-Behnken中心组合设计因素水平编码表，共计17组试验，试验测定结果如表1所示。

利用Design-Expert8.0分析软件对表1中的试验数据进行多元回归拟合，建立回归方程如下：水解度/%=37.04-2.3A-0.93B+0.94C-1.17AB+0.13AC-8.88×10-3BC-1.63A2+0.79B2-0.054C2

表1 响应面试验设计及结果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

该模型的方差分析结果如表2所示。

表2 回归模型方差分析Table 2 Analysis of variance for regression model

由表2可以看出，所建立的二次回归模型极显著（p＜0.01），失拟项不显著，说明模型与试验值结果拟合较好，具有代表性。表中A和A2项达到了极显著水平，B、C和AB项达到了显著水平，模型R2=0.946 5、Radj2=0.877 7，说明自变量和响应值之间线性关系显著，可将该模型用于榛仁分离蛋白水解工艺的理论推测。

各因素对榛仁蛋白水解物水解度的交互作用如图5所示，直观反映了各因素对响应值的影响。

图5 加酶量、pH和温度交互作用影响水解度的响应曲面图Fig.5 Response surface plots of mutual influence of three hydrolysis parameters on degree of hydrolysis

2.2.2 榛仁蛋白水解物制备工艺条件的确定

由Design-Expert分析得到Alcalase水解榛仁分离蛋白的最佳工艺条件为：加酶量10 000 U/g，pH8.5，温度53.47℃，底物浓度2.0%，模型预测的水解度可达39.81%。响应面回归模型的方差分析表明拟合较好。考虑到实际操作的情况，将条件修正为：加酶量10 000 U/g，pH8.5，温度 53.5℃，底物浓度 2.0%，在此条件下做验证试验，计算水解度为39.72%，与模型预测值较吻合，说明得到的水解工艺条件可靠，可用于进一步的研究。

3 结论

本试验以长白山榛仁分离蛋白为原料，用碱性蛋白酶Alcalase水解，通过响应面试验优化榛仁蛋白水解物的制备工艺。确定了榛仁蛋白水解物的最佳水解工艺条件为：加酶量10 000 U/g，pH8.5，温度53.5℃，底物浓度2.0%，水解度达39.72%。响应面优化后提高了榛仁蛋白水解物的水解度，这有利于榛仁蛋白水解物生物活性的进一步研究，为榛仁蛋白开发功能性食品和保健食品提供参考。

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Study on Preparation of Changbai Mountain Hazelnut Protein Hydrolysates

WANG Ming-shuang1，2，XU Jing1，2
（1.Development Engineering Center of Edible Plant Resources of Changbai Mountain，Tonghua Normal University，Tonghua 134002，Jinlin，China；2.Department of Pharmaceutics and Food Science，Tonghua Normal University，Tonghua 134002，Jinlin，China）

This paper took Changbai Mountain hazelnut protein isolated as raw material，prepared the hazelnut protein hydrolysates using the Alcalase，through the single factor and response surface experiment of the Alcalase volume，pH，temperature and substrate concentration，the optimal hydrolysis conditions were determined as：Alcalase volume 10 000 U/g，pH 8.5，temperature 53.5℃，substrate concentration 2.0%，hydrolysis time 150 min，the degree of hydrolysis of hazelnut protein hydrolysates reached 39.72%.

Changbai Mountain hazelnut；protein hydrolysates；response surface

2016-12-12

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.024

王明爽（1990—），女（满），助教，硕士，研究方向：生物转化与利用。