Kv1.5蛋白在内毒素致血管内皮细胞损伤中的作用机制*

许美霞， 邹丽绢， 张晓霞， 杨 涛， 许 涛

华中科技大学同济医学院附属普爱医院重症医学科，武汉 430034

Kv1.5蛋白在内毒素致血管内皮细胞损伤中的作用机制*

许美霞， 邹丽绢， 张晓霞， 杨 涛， 许 涛△

华中科技大学同济医学院附属普爱医院重症医学科，武汉 430034

目的 研究Kv1.5蛋白在内毒素致血管内皮细胞损伤中的作用机制。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，给予脂多糖(LPS)刺激建立脓毒症模型，并分为：空白对照组、LPS组、LPS+Kv1.5蛋白通道特异性阻滞剂MT1(250 nmol/L)组及LPS+MT2(500 nmol/L)组，DAPI染色免疫荧光观察各组HUVECs凋亡情况，Western blot检测Caspase-3及Bcl-2蛋白的表达，RT-PCR检测Caspase-3及Bcl-2基因的表达。结果 DAPI染色免疫荧光显示，LPS组内皮细胞核固缩、凋亡小体形成，凋亡小体形成率由空白对照组的(4.2±0.7)%增加至(26.7±0.8)%(P<0.01)，而250 nmol/L、500 nmol/L MT预处理后，凋亡小体形成率从LPS组(26.7±0.8)%分别下降至(12.4±1.0)%、(8.5±0.9)%(均P<0.01)；Western blot检测结果显示，LPS组较空白对照组Bcl-2蛋白表达减少、Caspase-3蛋白表达增加(均P<0.01)，给予500 nmol/L MT预处理后，与LPS组比较，Bcl-2蛋白表达上调、Caspase-3蛋白表达下调(均P<0.01)；RT-PCR检测结果显示，LPS组较空白对照组Bcl-2 mRNA表达下调、Caspase-3 mRNA表达上调(均P<0.01)，给予500 nmol/L MT预处理后，与LPS组比较，Bcl-2 mRNA表达上调、Caspase-3 mRNA表达下调(均P<0.01)。结论Kv1.5介导脓毒症相关内皮细胞损伤可能与线粒体凋亡途径有关。

Kv1.5蛋白； 人脐静脉内皮细胞； MT(mephetyl tetrazole)； 血管内皮细胞损伤

Kv1.5蛋白是一类电压依赖性氧敏感钾离子通道，在细胞的增殖、凋亡及炎症等病理过程中发挥重要作用，已经证实Kv1.5蛋白在内皮细胞中存在表达，并参与内皮细胞功能的调节[1-2]。近期研究表明，Kv1.5蛋白与H2O2、氧化低密度脂蛋白(OxLDL)等诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤密切相关[3]。本研究通过建立脓毒症模型，并给予Kv1.5蛋白通道特异性阻滞剂(MT，mephetyl tetrazole)干预后，观察内皮细胞凋亡情况，并检测内皮细胞Caspase-3、Bcl-2蛋白及基因的表达，以探讨Kv1.5是否通过线粒体凋亡途径介导脓毒症相关内皮细胞损伤。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)购自中国科学院细胞资源库。LPS购于Sigma公司，MT购于美国Santa Cruz公司，Caspase-3及Bcl-2一抗购于武汉三鹰生物技术有限公司，引物由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司合成。

1.2 HUVECs的培养

将冻存的HUVECs活化后，用含10%胎牛血清及双抗的DMEM培养液进行培养，12 h后更换新培养液。待细胞生长贴壁率达80%以上进行消化传代，在倒置显微镜下观察细胞形态，选取细胞状态良好的HUVECs进行实验。

1.3 脓毒症相关血管内皮细胞损伤模型建立

HUVECs常规培养，取对数生长期的血管内皮细胞，给予浓度5 μg/mL LPS刺激HUVECs共24 h。

1.4 实验分组

将HUVECs随机分为空白对照组、LPS组、LPS+MT1组、LPS+MT2组。空白对照组：完全培养液培养；LPS组：给予5 μg/mL LPS+培养液培养24 h；LPS+MT1组：予以250 nmol/L的MT预处理30 min后，给予5 μg/mL LPS+培养液培养24 h；LPS+MT2组：予以500 nmol/L的MT预处理30 min后，给予5 μg/mL LPS+培养液培养24 h。

1.5 DAPI染色免疫荧光观察血管内皮细胞凋亡情况

各组细胞按照分组分别处理后，用4%的多聚甲醛固定15 min，用DAPI染核20 min，在荧光显微镜下拍摄细胞图像观察细胞核形态。荧光显微镜下可见，活细胞核呈现弥散均匀荧光，而凋亡的细胞细胞核或细胞质内可见致密浓染的颗粒块状荧光，核出现固缩，可见DNA荧光碎片(凋亡小体)。分别选取5个视野，计数100个细胞，计算凋亡小体形成率=凋亡小体数/总的细胞数×100%，取5次结果的平均值。

1.6 Western blot检测Caspase-3及Bcl-2蛋白的表达

收集待测组织样品，BCA试剂盒测定待测样品蛋白浓度。用5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h。其中一抗用5%BSA封闭液按1∶200稀释，4℃孵育过夜。二抗(辣根过氧化物酶标记的IgG)用5%BSA封闭液按1∶2 000稀释，室温孵育2 h。用ECL显影。

1.7 实时定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测Caspase-3 mRNA及Bcl-2 mRNA的表达水平

用Trizol法提取总RNA，按Fermentas试剂盒说明书方法进行Real-time PCR检测，引物序列见表1。逆转录cDNA反应条件：25℃ 5 min，50℃15 min，85℃ 5 min，4℃10 min；30个循环，72℃ 4 min，4℃ 4 min；Real-time PCR反应条件：第一循环50℃ 2 min，95℃ 10 min，之后95℃ 30 s和60℃ 30 s共40个循环。以2-ΔΔCt法测得mRNA的表达量，并以各组与空白对照组的比值反映mRNA的相对表达量。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequences

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 DAPI染色免疫荧光观察各组内皮细胞凋亡情况

LPS组内皮细胞出现典型凋亡核形态学的改变，与空白对照组比较，细胞核不同程度固缩、凋亡小体形成增加，给予MT预处理后，可明显改善细胞凋亡情况(图1)。通过凋亡小体计算统计，LPS组凋亡小体形成率由空白对照组的(4.2±0.7)%增加至(26.7±0.8)%(P<0.01)，而250 nmol/L、500 nmol/L MT预处理后，凋亡小体形成率从LPS组(26.7±0.8)%分别下降至(12.4±1.0)%、(8.5±0.9)%(均P<0.01)。

2.2 各组内皮细胞Caspase-3及Bcl-2蛋白的表达水平

LPS组较空白对照组Caspase-3蛋白表达明显增加(P<0.01)，给予MT 250 nmol/L及500 nmol/L预处理后，与LPS组比较，Caspase-3蛋白表达下调(均P<0.01)(图2)。而LPS组Bcl-2蛋白表达明显低于空白对照组，给予MT 500 nmol/L预处理，Bcl-2蛋白表达明显上调(图2)。提示LPS诱导血管内皮细胞损伤时，下调Bcl-2蛋白表达、上调Caspase-3蛋白表达，给予MT预处理可上调Bcl-2蛋白表达、下调Caspase-3蛋白表达。

A：空白对照组；B：LPS组；C：LPS+MT1组；D：LPS+MT2组；箭头所示为凋亡小体图1 DAPI染色免疫荧光观察各组内皮细胞凋亡情况(DAPI染色，×200)Fig.1 Apoptosis of HUVECs detected by DAPI staining(DAPI staining，×200)

①空白对照组；②LPS组；③LPS+MT1组；④LPS+MT2组；与空白对照组比较，**P<0.01；与LPS组比较，##P<0.01图2 各组血管内皮细胞Caspase-3及Bcl-2蛋白的表达水平Fig.2 Protein expression of Caspase-3 and Bcl-2 in each group

2.3 各组内皮细胞Caspase-3 mRNA及Bcl-2 mRNA的表达水平

LPS组Caspase-3 mRNA表达水平较空白对照组增加(P<0.01)，给予MT预处理后，Caspase-3蛋白表达下调(P<0.01)(图3)；而LPS组Bcl-2 mRNA的表达水平较空白对照组降低(P<0.01)，给予MT预处理后，Bcl-2 mRNA的表达水平与LPS组比较表达上调(图3)。提示LPS诱导内皮细胞损伤时，下调了Bcl-2基因表达、上调Caspase-3基因表达，给予MT 250 nmol/L及500 nmol/L预处理可下调Caspase-3基因表达，而予以MT 500 nmol/L预处理，可上调Bcl-2基因表达。

①空白对照组；②LPS组；③LPS+MT1组；④LPS+MT2组；与空白对照组比较，**P<0.01；与LPS组比较，##P<0.01图3 各组血管内皮细胞Caspase-3 mRNA及Bcl-2 mRNA的表达水平Fig.3 Expression of Caspase-3 mRNA and Bcl-2 mRNA in each group

3 讨论

脓毒症及其相关病变脓毒性休克是临床常见的急危重症，病死率居高不下[4-5]。LPS是引起革兰阴性菌脓毒症及脓毒症休克的最主要原因，而其中内皮细胞是LPS作用的重要靶器官，LPS通过氧化脂质反应等途径直接或间接损伤血管内皮细胞，最终导致微循环障碍、脓毒性休克[6]。近期研究发现Kv1.5蛋白参与H2O2、氧化低密度脂蛋白(OxLDL)等诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤[3]。我们前期研究证实Kv1.5蛋白在血管内皮细胞中存在表达，给予LPS处理后，发现Kv1.5蛋白表达增加，提示Kv1.5蛋白可能与LPS诱导的血管内皮细胞损伤有关。本研究通过LPS建立脓毒症血管内皮细胞损伤模型，并给予MT干预后，观察内皮细胞凋亡情况，发现LPS组血管内皮细胞凋亡明显增加，而给予MT预处理后，血管内皮细胞凋亡有所减少，进一步证实Kv1.5蛋白与脓毒症相关血管内皮细胞损伤密切相关。

哺乳动物细胞凋亡主要有2种途径即细胞外和细胞内途径，两者最终通过活化的Caspase家族蛋白导致细胞裂解[7]。细胞外途径是膜受体介导的信号通路途径，而细胞内途径即线粒体途径。线粒体途径主要受Bcl-2家族蛋白的调控。Bcl-2位于线粒体外膜，其高表达可以保护线粒体膜的完整性，避免线粒体内细胞色素C等凋亡因子的释放，从而发挥抗细胞凋亡功能[8]。Caspase-3是位于胞质内的凋亡蛋白，受细胞色素C等凋亡因子的调控，其高表达可以促进细胞的裂解，导致细胞凋亡[9]。内皮细胞对于氧化应激介导的线粒体损伤极敏感。而氧化应激损伤在脓毒症发生发展的病理过程中发挥重要作用[10-11]。因此我们推测脓毒症相关血管内皮细胞损伤可能是通过线粒体途径完成的。我们的研究显示，脓毒症细胞模型组Bcl-2 mRNA低表达、Caspase-3 mRNA高表达，提示LPS通过线粒体途径诱导内皮细胞凋亡，而给予Kv1.5蛋白特异性通道阻滞剂MT后，Bcl-2 mRNA的表达有所增加、Caspase-3 mRNA表达减少，同样从蛋白表达水平也发现予以MT预处理后，Bcl-2蛋白的表达上调、Caspase-3蛋白表达下调，提示MT减少血管内皮细胞凋亡可能与线粒体凋亡途径有关。

本研究结果发现，MT通过阻断Kv1.5蛋白通道，减轻LPS诱导的内皮细胞损伤，并上调Bcl-2基因、蛋白的表达、下调Caspase-3基因、蛋白的表达，表明Kv1.5蛋白可能通过线粒体途径介导脓毒症相关内皮细胞凋亡。

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(2017-03-12 收稿)

Effect of Kv1.5 on Edotoxin-induced Endothelial Cell Injury

Xu Meixia，Zou Lijuan，Zhang Xiaoxiaetal

Critical Care Department，Wuhan Puai Hospital，Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Whuan 430034

Objective To study mechanism by which Kv1.5 protein promoted edotoxin-induced endothelial cell injury.Methods Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)were culturedinvitroand LPS was used to establish sepsis model.The cells were randomly divided into four goups：blank control group，LPS group，LPS+mephetyl tetrazole(MT)1(250 nmol/L)group and LPS+MT2(500 nmol/L)group.DAPI staining was used to observe the apoptosis of HUVECs in each group.Western blotting was used to detect expression of Caspase-3 and Bcl-2.The mRNA expression of Caspase-3 and Bcl-2 was detected by RT-PCR.Results DAPI staining showed that the rate of apoptotic body formation in LPS group increased from(4.2±0.7)%(blank control group)to(26.7±0.8)%(P<0.01)，and after pretreatment with 250 nmol/L，and 500 nmol/L MT，the rate of apoptotic body formation decreased from(26.7±0.8)% to(12.4±1.0)% and(8.5±0.9)%，respectively(bothP<0.01).Compared with control，the expression of Bcl-2 protein was significantly decreased and Caspase-3 in LPS group was increased (bothP<0.01).Compared with LPS group，after pretreatment with 500 nmol/L MT，the expression of Bcl-2 protein was significanlty increased and Caspase-3 was decreased (bothP<0.01).The expression of Bcl-2 mRNA in LPS group was down-regulated and Caspase-3 mRNA was up-regulated，as compared with control group (bothP<0.01).Compared with LPS group，after pretreatment with 500 nmol/L MT,the expression of Caspase-3 mRNA was down-regulated and Bcl-2 mRNA was up-regulated detected by RT-PCR(bothP<0.01).Conclusion Kv1.5 may mediate LPS-related HUVECs damage via the mitochondrial-ROS-vascular endothelial cell pathway.

Kv1.5 protein； human umbilical vein endothelial cells； mephetyl tetrazole； endothelial cell injury

*武汉市卫生计生委科研基金资助项目(No.wx14c64)；湖北省自然科学基金资助项目(No.ZRY2014001335)

R826.61

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.015

许美霞，女，1982年生，主治医师，E-mail：157006188@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：5955098@qq.com