c-Abl基因在AngⅡ诱导血管平滑肌细胞氧化应激中的作用*

孙图成， 周先吾， 李华东， 陈 澍， 许 菲 ， 蒋雄刚△

1广东省心血管病研究所，广东省人民医院心血管外科，广东省医学科学院,广州 510080 2华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科,武汉 430022 3武汉大学附属中南医院消化内科,武汉 430071

c-Abl基因在AngⅡ诱导血管平滑肌细胞氧化应激中的作用*

孙图成1#， 周先吾2#， 李华东2， 陈 澍2， 许 菲3， 蒋雄刚2△

1广东省心血管病研究所，广东省人民医院心血管外科，广东省医学科学院,广州 5100802华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科,武汉 4300223武汉大学附属中南医院消化内科,武汉 430071

目的 探讨c-Abl基因在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)氧化应激中的作用。方法 构建c-Abl基因过表达和沉默的慢病毒载体，并利用慢病毒转染的方法构建c-Abl过表达和沉默的VSMCs。实验分6组：①对照组、②AngⅡ组、③STI571组、④lenti-control组、⑤lenti-cAbl-shRNA组、⑥lenti-cAbl组。①～③组为正常VSMCs，③组用STI571预处理，④～⑥组为分别利用lenti-control、lenti-cAbl-shRNA、lenti-cAbl转染VSMCs，对照组用生理盐水干预，其余实验组用AngⅡ(1×10-7mol/L)干预30 min，并用Western blot测定c-Abl和p-cAbl蛋白表达量；活性氧测定：对照组用生理盐水干预，其余实验组用AngⅡ(1×10-7mol/L)干预36 h，流式细胞仪分别检测其活性氧分子(ROS)、二氢罗丹明(DHR)、二氢乙啶(DHE)水平。结果 AngⅡ刺激后，与对照组比较，lenti-cAbl组的c-Abl和p-cAbl蛋白表达最强，STI571组和lenti-cAbl-shRNA组p-cAbl蛋白表达最弱，而lenti-control组与AngⅡ组c-Abl和p-cAbl蛋白水平无明显差异。AngⅡ干预36 h后，VSMCs氧化应激产物(ROS、DHE、DHR)均增加，但lenti-cAbl组氧化应激水平最高，lenti-cAbl-shRNA组、STI571组的氧化应激水平较AngⅡ组有所降低。结论 利用慢病毒载体构建过表达c-Abl基因的VSMCs细胞系获得成功；c-Abl基因表达的增加与AngⅡ刺激下VSMCs的氧化应激程度呈正相关。

慢病毒载体； c-Abl基因； 血管平滑肌细胞； 氧化应激； 血管紧张素Ⅱ

主动脉夹层的发病机制尚未完全明了，近年来研究表明，主动脉壁中层血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)功能和结构的改变可能是导致主动脉夹层发生的原因之一[1]。

c-Abl基因编码的Abelson酪氨酸激酶(c-Abl)属于Src非受体酪氨酸激酶家族成员，其构成细胞骨架，参与细胞转化生长、细胞凋亡、细胞周期、感染和免疫等病理生理过程[2-3]。c-Abl在静息时为非活化状态，而磷酸化后形成p-cAbl行使激酶功能。我们前期的研究证实c-Abl基因与VSMCs的生物学行为相关，Abl基因敲除导致Crk相关底物(CAS)蛋白磷酸化和粘附相关的支架蛋白表达下降，肌动蛋白聚合受到抑制，VSMCs的张力降低[4]。同时，我们检测主动脉夹层患者的主动脉标本发现，与正常对照(心脏移植的供心)相比，夹层患者的主动脉标本中c-Abl活性和凋亡相关蛋白表达均增加[5]。但c-Abl基因与VSMCs的氧化应激的关系目前尚无研究报道。

为了研究c-Abl基因在血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)诱导VSMCs氧化应激中的作用，我们拟构建c-Abl基因过表达和沉默的慢病毒载体，并转染VSMCs，构建c-Abl基因过表达和沉默的VSMCs，通过观察不同c-Abl活性的VSMCs对AngⅡ诱导的氧化应激的反应，从而进一步揭示c-Abl基因在主动脉夹层发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

小鼠主动脉VSMCs细胞：美国ATCC细胞库中国代理公司；293T、HeLa细胞：中国科学院细胞库。

1.2 主要实验试剂

lipo 2000、嘌呤霉素(Puromycin)：美国Invitrogen公司；DMEM高糖培养液、胎牛血清、opti-MEM：美国Gibco公司；表达质粒：永联生物科技(上海)有限公司；包装质粒：美国ADDGENE公司；DMSO、TBS缓冲液、青-链霉素双抗、胰蛋白酶、AngⅡ：美国Sigma公司；信号转导抑制剂-571(STI571)：美国Selleck公司；c-Abl shRNA慢病毒颗粒、对照的shRNA慢病毒颗粒、copGFP对照的慢病毒颗粒：美国Santa Cruz公司；鼠抗β-actin抗体：天津三箭公司；兔抗P-CABL抗体：美国Assay Biotech公司；兔抗CABL抗体：美国Santa Cruz公司；活性氧检测试剂盒、Dihydroethidium(超氧化物阴离子荧光探针)：上海碧云天公司；活性氧ROS荧光探针Dihydrorhodamine：南京凯基生物公司。

1.3 实验方法

1.3.1 慢病毒载体的构建 (1)XbaⅠ和BamHⅠ分别酶切pUC57-cAbl和pCDH-EF1-MCS-T2A-PURO；(2)DNA凝胶电泳分别回收cAbl及pCDH骨架，大小分别为3 435 bp和7 066 bp；(3)利用T4连接酶对片段进行连接；(4)连接上目的基因的质粒转化大肠埃希菌，让目的基因在大肠埃希菌里扩增，然后提取质粒。

1.3.2 慢病毒包装与浓缩 在准备好的293T细胞中，加入表达质粒及包装质粒(pCDH-EF1-PURO-cAbl∶pSpAX2.0∶pCMV-VSV-G = 12 μg∶8 μg∶4 μg)以及500 μL的无血清Opti-MEM，轻柔混匀后加入lipo2000室温孵育，将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀，室温孵育。293T细胞更换新鲜培养液后，加入上述的混合物，12 h后换液。转染48～72 h后收集含病毒的上清液，离心后加入5×PEG-8000 NaCl母液(NaCl 8.766 g∶PEG-8000 50 g溶解于200 mL Milli-Q纯水中)5 mL。混匀、过夜、离心、弃上清，加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀。浓缩后的病毒悬液储存于-80 ℃冰箱。

1.3.3 慢病毒滴度测定 将病毒按稀释度分别为1∶105～109梯度稀释，将稀释好的病毒液接种于HeLa细胞中，接种病毒24 h后，加终浓度为0.3 μg/mL的嘌呤霉素处理细胞7 d后，选取合适的稀释度，计数HeLa细胞的细胞集落个数，并计算病毒滴度。病毒滴度=细胞集落个数×病毒稀释度(单位：TU/mL)。在本实验中，构建的过表达慢病毒滴度为：1×1010TU/mL。

1.3.4 感染复数(MOI)的测定 将copGFP 对照的慢病毒颗粒在冰上解冻后，按MOI值分别为1、10、100的比例，把溶解的copGFP对照的慢病毒颗粒加入计数好的VSMCs中，12 h后换液继续培养。24～48 h后荧光显微镜下观察荧光强度，为下一步慢病毒转染挑选出合适的MOI值。

1.3.5 构建稳定转染的VSMCs 将c-Abl shRNA慢病毒颗粒、对照的shRNA慢病毒颗粒、c-Abl慢病毒颗粒在冰上解冻后，分别按合适的MOI值加入VSMCs中，12 h后换液。24～48 h后加入嘌呤霉素进行筛选，每3天换1次含有嘌呤霉素的培养液，1周后通过Western blot验证转染细胞系是否成功构建。

1.3.6 实验分组 实验分成6组：①对照组、②AngⅡ组、③STI571组、④lenti-control组、⑤lenti-cAbl-shRNA组、⑥lenti-cAbl组。①～③组为正常VSMCs，其中，③组加入终浓度为2×10-6mol/L的STI571预干预2 h；④～⑥组为分别利用lenti-control、lenti-cAbl-shRNA、lenti-cAbl慢病毒载体转染的VSMCs。

1.3.7 Western blot检测 分组同前，对照组进行生理盐水干预，其余各实验组加入AngⅡ(1×10-7mol/L)，30 min后收集各实验组的细胞，提取蛋白后-80℃冷冻。用BCA法测样品蛋白浓度，计算所需蛋白量。依据要求加入蛋白样品30 μg和蛋白marker 5 μL，制10%的SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶。电泳初始为60 V，待溴酚蓝指示剂在2种胶分界处时电压调至100 V。恒流280 mA转移90 min。一抗孵育后加入相应二抗(抗体稀释比：β-actin 1∶8 000，兔抗P-CABL抗体1∶1 000，兔抗CABL抗体1∶500)。化学发光，显影和定影，曝光，得到胶片。实验结果判读：阳性条带以Quantity One 4.62版凝胶吸光度分析软件进行分析。

1.3.8 氧化应激检测 分组同前，对照组进行生理盐水干预，其余各实验组AngⅡ(1×10-7mol / L)处理，36 h后胰酶消化收集各组细胞后装载探针。ROS检测：稀释DCFH-DA使终浓度为10 μL/L，细胞收集好后悬浮于配好的DCFH-DA中；DHE检测：Dihydroethidium探针用DMSO稀释成15 mmol/L储存浓度，-20℃保存，按照1∶3 000用无血清培养液稀释Dihydroethidium，使终浓度为5 μmol/L；DHR检测：按照1∶300用无血清培养液稀释Dihydrorhodamine，使终浓度为10 mmol/L。细胞浓度均为1×108/mL，在37℃培养箱中孵育细胞20 min；孵育终止后用无血清培养液洗涤3次，PBS重悬细胞，上机检测；流式细胞仪各项数据分析采用WinMDI 2.9软件进行。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 质粒图谱

本研究设计的c-Abl过表达质粒载体图谱见图1。

2.2 酶切验证

目的基因克隆PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果(图2)，与设计的克隆片段大小相符。

2.3 病毒转染MOI值测定

按MOI值分别为1、10、100的比例，把copGFP对照的慢病毒颗粒转染VSMCs，培养24 h后换液，荧光显微镜下观察到：随着MOI值的倍增，细胞荧光的亮度增加，遂以MOI值100作为细胞感染密度(图3)。

图1 pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-cAbl质粒图谱Fig.1 Plasmid map of pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-cAbl

M:Marker;1:PCR产物图2 pUC57-cAbl酶切图Fig.2 Digestion of pUC57-cAbl by XbaⅠand BamHⅠ

2.4 转染后过表达及沉默VSMCs的c-Abl和p-cAbl蛋白表达

6孔板培养不同组细胞，密度达到70%时，对除对照组外的实验组进行AngⅡ(1×10-7mol/L)干预30 min(对照组用生理盐水干预30 min)，并用Western blot测定c-Abl和p-cAbl蛋白表达量。由结果(图4)可知：慢病毒可稳定转染并传代，转染后的c-Abl蛋白表达符合预期，AngⅡ刺激后，与对照组比较，过表达组(lenti-cAbl组)的c-Abl和p-cAbl蛋白表达最强(P<0.05，P<0.01)，c-Abl激活抑制组(STI571组)和沉默组(lenti-cAbl-shRNA组)p-cAbl蛋白表达最弱(均P<0.01)，而慢病毒对照组(lenti-control)与AngⅡ组无明显差别(P>0.05),但均较对照的p-cAbl蛋白水平有明显升高(均P<0.01)。以上实验结果表明，慢病毒过表达VSMCs细胞系构建成功。

A：MOI值=1；B：MOI值=10；C：MOI值=100图3 不同MOI值的慢病毒转染VSMCs后的荧光照片(×200)Fig.3 Fluorescence pictures of VSMCs transfected with lentivirus of different MOI values (×200)

1：对照组；2：AngⅡ组；3：STI571组；4：lenti-control组；5：lenti-cAbl-shRNA组；6；lenti-cAbl组；与对照组比较,*P<0.05 **P<0.01图4 各实验组的c-Abl和p-cAbl蛋白表达Fig.4 Expression of c-Abl and p-cAbl protein in each experimental group

2.5 c-Abl对AngⅡ刺激下的VSMCs氧化应激的影响

6孔板培养已分组的细胞，当细胞密度为70%时，对除对照组外的实验组AngⅡ(1×10-7mol/L)干预36 h(对照组用生理盐水干预36 h)后，流式细胞仪检测各组氧化应激水平(ROS、DHE、DHR)。流式细胞技术检测氧化应激结果(图5、6、7)：AngⅡ干预后，VSMCs氧化应激产物(ROS、DHE、DHR)均增加(均P<0.05)，lenti-cAbl组氧化应激水平最高(均P<0.05)，lenti-cAbl-shRNA组、STI571组的氧化应激水平较AngⅡ组有所减低(均P<0.05)。因此，c-Abl激酶活性与AngⅡ刺激下VSMCs的氧化应激程度呈正相关。

A：各组ROS流式图；B：各组ROS荧光强度柱状图；与AngⅡ组比较,*P<0.05；与Control组比较,#P<0.05 图5 各实验组ROS强度差异Fig.5 Difference of ROS intensity in each experimental group

A：各组DHE流式图；B：各组DHE荧光强度柱状图；与AngⅡ组比较,*P<0.05；与Control组比较,#P<0.05 图6 各实验组DHE强度差异Fig.6 Difference of DHE intensity in each experimental group

A：.各组DHR流式图；B：各组DHR荧光强度柱状图；与AngⅡ组比较,*P<0.05；与Control组比较,#P<0.05 图7 各实验组DHR强度差异Fig.7 Difference of DHR intensity in each experimental group

3 讨论

主动脉夹层的发生与动脉中层的退行性变相关，动脉中层主要由VSMCs和细胞外基质(ECM)组成，其中VSMCs对维持主动脉壁的完整性和收缩功能具有重要作用，其损伤或生物学行为的改变是主动脉夹层产生的重要原因之一[6-7]。

慢病毒载体是一种以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒为基础发展起来的基因表达载体，可长时间、稳定地表达外源基因。相比于腺病毒，其优点在于可以有效地感染多种难感染的细胞，比如原代细胞、干细胞、神经元细胞等，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景[8-10]。在本实验中使用的是pCDH系列慢病毒载体，构成过表达的重组慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-cAbl，将慢病毒载体转入到HeLa细胞，并用嘌呤霉素处理细胞7 d后，选取合适的稀释度计算病毒滴度。

前期研究发现，c-Abl与VSMCs的生物学行为相关，c-Abl基因是Abelson小鼠白血病病毒原癌基因v-abl的同源基因，位于人的第9号染色体，其编码蛋白的分子量为140 kD，分布于包括VSMCs、内皮细胞、成纤维细胞在内的多种细胞和组织的细胞核、细胞质中。c-Abl激活后使下游的Crk相关底物(p130CAS)磷酸化，而磷酸化的p130CAS与CrkⅡ及DOCK180蛋白形成复合体，是调节下游信号GTP结合蛋白Rac1的关键步骤，Rac1则通过作用于JNK和Nox调控相关基因表达[11]，参与细胞骨架重塑、DNA损伤和氧化应激、细胞凋亡、细胞转化等生命活动。在本实验中，我们验证了c-Abl在静息时为非活化状态，而磷酸化后形成p-cAbl实现激酶功能。信号转导抑制剂-571(STI571)可粘附于c-Abl的无活性构象[12]，占据其激活环和螺旋αC之间的空间，防止激活环构象改变，从而阻止c-Abl的磷酸化激活。实验中，我们利用shRNA下调了c-Abl表达，利用c-Abl激活抑制剂STI571抑制了c-Abl的活性成分p-cAbl。研究结果表明，下调c-Abl基因的表达，或降低其活性均可使AngⅡ导致的VSMCs氧化应激效应降低，提示c-Abl基因在VSMCs过氧化损伤中的非保护性调控作用。

主动脉夹层是凶险复杂的大血管疾病，目前认为主动脉壁中层VSMCs的损伤在主动脉夹层病变的形成过程中起到重要作用[13-14]，而大量过氧化物的产生可加重VSMCs的损伤。我们发现AngⅡ诱导的c-Abl激活是ROS依赖性的，并且c-Abl活性越高，其ROS产物越多。AngⅡ通过活化一种质膜蛋白NAD(P)H氧化酶，并以此为第二信使，介导有丝分裂原的信号转导，从而导致VSMCs增殖[15]。ROS可通过MAPKs通路、NF-κB通路调控MMP的表达，影响细胞外基质的成分，改变弹性纤维的合成与降解过程[16-17]，这可能是引发夹层的原因之一。本实验中，c-Abl活性被抑制后，AngⅡ导致的VSMCs氧化应激水平也降低，VSMCs的损伤可能减少。因此，通过抑制c-Abl活性而阻断AngⅡ诱导VSMCs的氧化应激效应，可能成为预防主动脉夹层发生、发展的治疗靶点。

综上所述，本实验通过在DNA、RNA、蛋白质3个水平观察具有不同活性cAbl的VSMCs在AngⅡ刺激后的氧化应激效果，发现c-Abl基因过表达的VSMCs，其AngⅡ刺激后的氧化应激效应增加，而c-Abl基因沉默和c-Abl活性抑制的VSMCs，其AngⅡ刺激后的氧化应激效应降低。这些结果提示c-Abl基因与AngⅡ诱导的VSMCs氧化应激呈正相关。但其介导的具体信号通路和分子机制，尚需进一步研究论证。

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(2017-04-22 收稿)

Role of c-Abl Gene in AngⅡ-induced Oxidative Stress of Vascular Smooth Muscle Cells

Sun Tucheng1#，Zhou Xianwu2#，Li Huadong2etal

1Guangdong Cardiovascular Institute，Guangdong General Hospital，Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangzhou 510080，China2Department of Cardiovascular Surgery，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Objective To investigate the role of c-Abl gene in angiotensinⅡ(AngⅡ)-induced oxidative stress in vascular smooth muscle cells(VSMCs).Methods We constructed the c-Abl gene overexpression and silence lentiviral vectors and used lentivirus transfection method to construct c-Abl overexpression and silence VSMCs.The test group VSMCs were divided into six groups：control group，AngⅡ group，STI571 group，lenti-control group，lenti-cAbl-shRNA group，lenti-cAbl group (groups 1-6).Groups 1-3 were normal VSMCs，Group 3 was pretreated with STI571，and groups 4-6 were VSMCs transfected by lenti-control，lenti-cAbl-shRNA and lenti-cAbl，respectively.the control group was treated with normal saline for 30 min，while the other experimental groups were treated with AngⅡ(1×10-7mol/L)for 30 min，then we used Western blotting to detect the protein expression of c-Abl and p-cAbl.For determination of reactive oxygen species(ROS)，the control group was treated with normal saline，while the other experimental groups were treated with AngⅡ(1×10-7mol/L)for 36 h，then flow cytometry was used to detect the oxidative stress levels of reactive oxygen species(ROS)，dihydroethidium(DHE)and dihydrorhodamine(DHR)，respectively.Results Compared with the control group，the expression of p-cAbl protein was the highest in the lenti-cAbl group and the weakest in STI571 and lenti-cAbl-shRNA groups.There were no significant differences in the levels of c-Abl and p-cAbl protein between lenti-control group and AngⅡ group.ROS，DHE and DHR levels increased after 36 h of AngⅡ stimulation，but the oxidative stress level of lenti-cAbl group was the highest among all the groups.Compared with the AngⅡ group，the oxidative stress levels of lenti-cAbl-shRNA group and STI571 group were reduced.Conclusion The VSMCs with the overexpressing c-Abl gene was successfully constructed by lentiviral vector technique.The increase of c-Abl gene expression was positively correlated with the oxidative stress of VSMCs stimulated by AngⅡ.

lentiviral vector； c-Abl gene； VSMCs； oxidative stress; angiotensinⅡ

*国家自然科学基金资助项目(No.81370416)

R543.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.003

#共同第一作者

孙图成，男，1973年生，副教授，E-mail：suntucheng@126.com；周先吾，男，1991年生，医学硕士，E-mali：zhouxianwu1991@hotmail.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：jiangxionggang@hotmail.com