微小核糖核酸101异常表达与乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的关系

刘平贤，张浩，李鹍鹏

（河南省南阳市中心医院 乳腺外科，河南 南阳 473009）

微小核糖核酸101异常表达与乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的关系

刘平贤，张浩，李鹍鹏

（河南省南阳市中心医院 乳腺外科，河南 南阳 473009）

目的探讨微小核糖核酸101（miRNA-101）在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达及其对MDAMB-231细胞增殖的影响。方法实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常乳腺上皮细胞MCF-10A中miRNA-101的表达。采用LipofectamineTM2000将miRNA-101-mimic/ inhibitor/NC分别转染至MDA-MB-231细胞中，通过qRT-PCR检测miRNA-101的转染效率，CCK-8实验检测MDA-MB-231细胞的增殖。结果miRNA-101在MDA-MB-231细胞中的表达水平低于正常乳腺细胞MCF-10a（P＜0.01）。转染miRNA-101 mimic后MDA-MB-231细胞的增殖能力减弱（P＜0.05），而转染miRNA-101 inhibitor后细胞的增殖能力增强（P＜0.05）。结论miRNA-101在乳腺癌细胞MDA-MB-231中低表达，转染miRNA-101 mimic后乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖减弱。

乳腺癌；MDA-MB-231；miRNA-101；增殖

微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）是内源性非编码短链RNA，在转录后水平调节血管生成、细胞周期、细胞凋亡、细胞侵袭和迁移等肿瘤相关基因的表达，进而影响肿瘤的增殖、侵袭和转移，最终可导致肿瘤的发生[1-2]。有研究表明，miRNA-101在前列腺癌、膀胱癌等多种癌症中表达下调并与肿瘤发生发展密切相关[3]。研究报道，miRNA-101可通过调控COX-2的表达从而抑制肺癌和宫颈癌细胞的增殖和侵袭[4-5]。在乳腺癌中也发现多种miRNA表达异常，但miRNA-101在乳腺癌中的表达及其在乳腺癌发生、发展中的机制研究尚少[6]。本研究拟采用乳腺癌MDA-MB-231、正常乳腺上皮MCF-10A细胞，观察miRNA-101在两者中表达的差异并探讨其对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 MDA-MB-231为人乳腺癌细胞株，MCF-10A为人正常乳腺上皮细胞，作为正常组[7]，两细胞株均由本实验室购于美国模式培养物储存库（ATCC），用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37℃、5%二氧化碳CO2的培养箱中培养。

1.1.2 主要试剂与仪器 RPMI 1640培养基（购自美国Gibco公司），胎牛血清（购自上海依科赛公司），Trizol试剂、总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒（购自日本TaKaRa公司），miRNA-101引物（上海生工生物工程有限公司合成），转染试剂LipofectamineTM2000、Opti-MEM（购自美国Invitrogen公司），miRNA-101 mimic、miRNA-101 inhibitor及miRNA NC（合成自美国Invitrogen公司），CCK-8试剂盒（购自碧云天生物技术研究所），6孔板、96孔板和细胞培养皿（购自美国Corning公司），细胞培养箱（购自美国Thermo公司），PCR仪（BS97MyCycler）（购自美国BIO-RAD公司），qRT-PCR（ABI-7500）仪（购自美国ABI公司），倒置显微镜（TS100-F）（购自日本尼康公司），酶标仪（Multiskan Ascent）（购自美国Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR检测miRNA-101在正常乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达 将MCF-10A和MDA-MB-231细胞分别按照1.0×105～1.5×105个/孔细胞浓度接种6孔板，48 h后分别收集细胞，PBS洗涤，12 000r/min离心5min后，加入0.5ml Trizol。按照miRNA分离提取试剂盒所提供的步骤提取miRNA。用紫外分光光度计测定所提取RNA的浓度及纯度，之后将其逆转录为cDNA，反应条件：25℃保持30min，再42℃保持30min，最后85℃保持5min。以cDNA为模板，按照qRT-PCR剂盒提供的步骤加入相关试剂及miRNA-101引物（见表1），以U6为内参（见表1），在ABI-7500实时荧光定量仪上进行PCR扩增。反应条件：先95℃下保持3min，然后做40次循环；每次循环为95℃保持12 s，再62℃保持40 s。

表1 qRT-PCR的引物

1.2.2 miRNA转染 MDA-MB-231细胞按照1.0×105～1.5×105个/孔细胞浓度接种6孔板，置于37℃、5%CO2孵箱培养24h，细胞融合率为30%～50%时进行转染。分别转染miRNA-101 mimic、miRNA-101inhibitor及miRNA NC，序列分别如下：miRNA-101 mimic：5'-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3'，miRNA-101 inhibitor：5'-UUCAGUUAUCACAGUAC UGUA-3'，miRNA NC：5'-UCACAACCUCCUAGAAA GAGUAGA-3'。按照LipofectamineTM2000使用说明书瞬时转染。转染24h后，分别收集细胞，qRT-PCR检测转染后细胞内miRNA-101的表达水平，操作方法按照1.2.1。

1.2.3 CCK-8法检测miRNA-101过表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231活力的影响 将MDA-MB-231细胞以2×103个/孔细胞，加入96孔培养板中，培养24 h后分别转染miRNA-101 mimic、miRNA-101 inhibitor及miRNA NC，并设置MDA-MB-231空白转染组，每组6个复孔。分别在转染后24、48、72及96 h加入10μl CCK-8溶液，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育1h。选择450 nm波长，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值（OD），另设单孔只加入培养基不加入MDA-MB-231细胞作为空白对照。细胞活力×（%）=[A（加药）-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）]×100%，其中A（加药）为具有细胞、CCK溶液和药物溶液孔的吸光度，A（空白）为具有培养基和CCK溶液而没有细胞孔的吸光度，A（0加药）为具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液孔的吸光度。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）描述，均行正态性检验。多组间采用单因素方差分析（one way ANOVA），多时点观测资料则行重复测量设计的方差分析；两组间的比较用t检验（Student's t test）或LSD-t检验，时间比较为调整显著性水准后的差值t检验；此外相关性分析用非参数相关性Spearman检验；时间比较的显著性水准α’按Bonferroni校正法调整，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-101在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达

miRNA-101在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达相对值为（0.61±0.09），正常乳腺上皮细胞MCF-10a中的相对表达值为（1.00±0.01），经t检验，差异有统计学意义（t=10.550，P=0.000）。

2.2 miRNA-101 mimic及miRNA-101 inhibitor成功转染MDA-MB-231细胞

miRNA-101转染后，各组miRNA-101的表达相对值比较，差异有统计学意义（F=1 746.649，P=0.000）。mimic组细胞内miRNA-101的表达相对值为（6.03±0.31），与miRNA NC组细胞内miRNA-101的表达相对值（1.00±0.00）比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；miRNA-101 inhibitor转染后，细胞内miRNA-101的表达相对值为（0.45±0.05），与miRNA NC组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 miRNA-101对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用

在miRNA-101-mimic/inhibitor/NC转染MDAMB-231细胞后，分别于24、48、72及96 h时检测细胞增殖活力。经多因素重复测量设计的方差分析，结果发现：①不同时间的细胞活力有差异（F=2193.131，P=0.000）；②组间细胞活力有差异（F=449.528，P=0.000），过表达miRNA-101后，MDA-MB-231的细胞增殖活力低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而沉默miRNA-101后，MDA-MB-231的细胞增殖活力高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而miRNA NC与空白对照组（Con组）差异无统计学意义（P＞0.05）；③实验组与对照组的细胞活力变化趋势有差异（F=150.024，P=0.000），miRNA-101可以抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖。见表2和附图。

表2 miRNA-101对MDA-MB-231细胞活力的影响 （n=6，%，±s）

表2 miRNA-101对MDA-MB-231细胞活力的影响 （n=6，%，±s）

组别96 h Con组 8.49±0.88 52.79±5.34 93.57±8.16 111.85±10.18 miRAN NC组 10.43±0.77 53.50±5.59 95.53±7.47 119.47±10.27 mimic组 3.24±0.25 20.22±0.57 45.15±2.25 66.21±5.31 inhibitor组 35.18±2.77 101.45±8.00 190.33±11.20 244.13±14.3124 h48 h72 h

附图 表达miRNA-101抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞体外增殖能力

3 讨论

乳腺癌是目前女性最常见的恶性肿瘤，在我国发病率呈逐年上升趋势，是常见的女性恶性肿瘤患者第6位死亡原因[8]。分子靶向治疗是近年来新兴的治疗手段，寻找有效的治疗靶点是其研究的热点，而miRNA的出现为研究乳腺癌的诊断和治疗提供新的靶点[3，9]。

miRNA-101是哺乳动物常见序列之一，在多种细胞中检测到miRNA-101存在。人类miRNA-101包含2种前体RNA：miRNA-101-1和miRNA-101-2；其长度分别为75和79 bp，成熟miRNA-101含21个碱基对。miRNA库中（http：//mirbase.org）显示其可与EZH2及MYCN基因特异性结合发挥调节作用，与前者结合力较强。大量研究表明，在肿瘤的发生与发展过程中，miRNA-101可抑制细胞分裂增殖，并在凋亡调控中起重要作用，其在功能上表现为抑癌基因特性[10-12]。

目前在前列腺癌、肝细胞癌等多种肿瘤中发现miRNA-101表达下调，对EZH2基因具有负调控作用[13]；在大肠癌细胞中，miRNA-101通过下调SphK1的表达从而抑制大肠癌细胞的生长[14]，说明miRNA-101与体外肿瘤细胞迁移、浸润、克隆形成和发生肿瘤密切相关。本实验miRNA-101在MDA-MB-231细胞中低表达。采用CKK-8法测定细胞增殖活性，结果显示，上调miRNA-101表达，随时间推移，呈抑制乳腺癌细胞增殖趋势，下调miRNA-101表达，随时间推移，乳腺癌细胞增殖能力增强。表明miRNA-101可抑制乳腺癌细胞分裂增殖，在功能上表现为抑癌基因特性。

在前列腺癌、乳腺癌及膀胱癌等肿瘤中，miRNA-101通常靶向作用于EZH2基因的3'-端非翻译区。miRNA通常在转录后水平对靶基因调控，与靶基因的mRNA的3'-端的非翻译区以碱基配对的方式来执行对靶基因的切割或者翻译的抑制功能，从而实现自身的功能。然而在乳腺癌中，miRNA-101的靶基因的确定需要进一步研究。

[1]NEGRINI M,CALIN G A.Breast cancer metastasis:a microRNA story[J].Breast Cancer Res,2008,10(2):203.

[2]方蕾,金艺凤.miRNA与肺癌的关系[J].辽宁医学院学报,2016, 37(1):109-112.

[3]GUI T,SHEN K.miRNA-101:a potential target for tumor therapy[J].Cancer Epidemiol,2012,36(6):537-540.

[4]LV P,ZHANG P,LI X,et al.Micro ribonucleic acid(RNA)-101 inhibits cell proliferation and invasion of lung cancer by regulating cyclooxygenase-2[J].Thorac Cancer,2015,6(6):778-784.

[5]HUANG F,LIN C,SHI Y H,et al.MicroRNA-101 inhibits cell proliferation,invasion,and promotes apoptosis by regulating cyclooxygenase-2 in Hela cervical carcinoma cells[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(10):5915-5920.

[6]YAHYA S M,ELSAYED G H.A summary for molecular regulations of miRNAs in breast cancer[J].Clin Biochem,2015,48(6): 388-396.

[7]GRIEVE S,GAO Y,HALL C,et al.Calpain genetic disruption and HSP90 inhibition combine to attenuate mammary tumorigenesis[J].Mol Cell Biol,2016,36(15):2078-2088.

[8]郑莹,吴春晓,吴凡,等.中国女性乳腺癌死亡现况和发展趋势[J].中华预防医学杂志,2011,45(2):150-154.

[9]CORCORAN C,FRIEL A M,DUFFY M J,et al.Intracellular and extracellular microRNAs in breast cancer[J].Clin Chem,2011, 57(1):18-32.

[10]HWANG C,GIRI V N,WILKINSON J C,et al.EZH2 regulates the transcription of estrogen-responsive genes through association with REA,an estrogen receptor corepressor[J].Breast Cancer Res Treat,2008,107(2):235-242.

[11]YOON K A,GIL H J,HAN J,et al.Genetic polymorphisms in the polycomb group gene EZH2 and the risk of lung cancer[J]. J Thorac Oncol,2010,5(1):10-16.

[12]FU L L,WEN X,BAO J K,et al.MicroRNA-modulated autophagic signaling networks in cancer[J].Int J Biochem Cell Biol,2012,44(5):733-736.

[13]LIU J X,ZHANG Q F,TIAN C H,et al.miRNA-101 inhibits the expression of the enhancer of zeste homolog 2 in androgen-independent prostate cancer LNCaP cell line[J].National Journal of Andrology,2015,21(6):500-503.

[14]CHEN M B,YANG L,LU P H,et al.MicroRNA-101 downregulates sphingosine kinase 1 in colorectalcancercells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2015,463(4):954-960.

Preliminary study of correlation between abnormally expressed miRNA-101 and proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells

Ping-xian Liu,Hao Zhang,Kun-peng Li
(Department of Breast Surgery,Nanyang Central Hospital,Nanyang,Henan 473009,China)

ObjectiveTo investigate the expression of miRNA-101 and its effect on the proliferation ability in breast cancer MDA-MB-231 cells.MethodsqRT-PCR was used to detect the expression of miRNA-101 in breast cancer MDA-MB-231 cells and normal mammary epithelial MCF-10A cells.miRNA-101-mimic/inhibitor/NC were transfected into MDA-MB-231 cells by LipofectamineTM2000.qRT-PCR was used to detect the transfection efficiency.CCK-8 assay was used to evaluate the proliferation ability of MDAMB-231 cells after the transfection.ResultsThe expression of miRNA-101 in MDA-MB-231 cells was significantly lower than that in MCF-10a cells (P＜0.05).The proliferation ability of MDA-MB-231 cells was significantly decreased after transfection with miRNA-101 mimic (P＜0.05),while the proliferation ability was significantly increased after transfection with miRNA-101 inhibitor (P＜0.05).ConclusionsmiRNA-101 is down-regulated in MDA-MB-231 cells.The proliferation ability of breast cancer MDA-MB-231 cells is inhibited after transfection with miRNA-101-mimic.

breast cancer;MDA-MB-231;miRNA-101;proliferation

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.009

1005-8982（2017）18-0047-04

2016-05-09