硫化氢对高糖腹膜透析液诱导大鼠腹膜结构和功能损伤的影响

卢 颖 高芦燕 宋 锴 王 峙 沈华英

硫化氢对高糖腹膜透析液诱导大鼠腹膜结构和功能损伤的影响

卢 颖 高芦燕 宋 锴 王 峙 沈华英

目的：观察硫化氢(H2S)对高糖腹膜透析液诱导大鼠腹膜结构和功能损伤的影响。 方法：SD大鼠随机分为四组(对照组、单独H2S组、模型组及治疗组)。第28天行腹膜平衡试验；取壁层腹膜组织观察腹膜结构变化，检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白Ⅲ(Col-Ⅲ)和转化生长因子β1(TGF-β1)表达情况。检测大鼠腹膜间皮细胞单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素6(IL-6)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、α-SMA、E-钙黏素(E-cadherin)和TGF-β1 mRNA表达情况。 结果：与对照组相比，模型组腹膜增厚伴血管增生、炎症细胞浸润增加，且间皮下α-SMA、Col-Ⅲ及TGF-β1表达显著增加(P<0.05)；与模型组相比，治疗组腹膜形态明显改善，α-SMA、Col-Ⅲ及TGF-β1表达显著减少(P<0.05)。与对照组相比，模型组超滤量显著减少，腹膜通透性显著升高，治疗组大鼠腹膜转运功能显著改善(P<0.05)。2.5%葡萄糖透析液刺激腹膜间皮细胞12h使肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA表达显著增加、上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达显著减少，同时MCP-1、IL-6、ICAM-1和TGF-β1 mRNA表达显著增加(P<0.01)；透析液中加入100 μmol/L、300 μmol/L NaHS可显著抑制上述炎症因子及纤维化因子表达(P<0.01)。 结论：在腹膜透析液中加入外源性H2S可显著改善腹膜结构及功能损伤，并可部分逆转腹膜间皮细胞转分化，进而减少炎症因子和纤维化因子合成。

腹膜透析 硫化氢 腹膜纤维化 腹膜间皮细胞转分化

腹膜透析(PD)是终末期肾病患者主要替代治疗方法之一。生物不相容的腹膜透析液(PDF)和反复发生的腹膜炎可引起腹膜纤维化，致使PD患者退出PD治疗。因此，寻找有效的抗腹膜纤维化药物是PD基础研究的热点之一。研究表明多种器官纤维化过程中伴有内源性硫化氢(H2S)缺乏[1-3]。我们前期研究证实H2S可抑制肾间质纤维化[1]，减轻高糖PDF所致的腹膜间皮细胞损伤[4]， 提示H2S可能具有抗腹膜纤维化作用。为此，本课题利用4.25%葡萄糖PDF联合脂多糖(LPS)建立腹膜纤维化模型，使用H2S供体硫氢化钠(NaHS)进行干预，观察H2S对大鼠腹膜结构及功能的影响，并进一步探讨H2S对高糖PDF诱导腹膜间皮细胞损伤的干预作用，以期为防治腹膜纤维化提供新思路。

材料与方法

试剂 4.25%和2.5%葡萄糖PDF(美国Baxter)；LPS、NaHS(美国Sigma)；DMEM/F12培养液、0.25%胰酶、0.05%胰酶、胎牛血清、青链霉素(美国GIBCO)；小鼠抗α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体、兔抗胶原蛋白Ⅲ(Col-Ⅲ)抗体、小鼠抗转化生长因子β1(TGF-β1)抗体(英国Abcam)；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、免疫组织化学超敏试剂盒(美国VECTOR)。

动物模型建立 20只雄性SD大鼠(200±10)g，随机分为四组。对照组：0.9%生理盐水20 ml/d腹腔注射；单独H2S组：NaHS 56 μg/(kg·d)溶于0.9%生理盐水，20 ml/d腹腔注射；模型组：4.25%葡萄糖PDF 20 ml/d腹腔注射，第1,3,5,7天予LPS 0.6 mg/kg加入PDF中腹腔注射；治疗组：造模同时予NaHS 56 μg/(kg·d)加入PDF腹腔注射，持续28d。

腹膜功能检测 给药28d后，行腹膜平衡试验(PET)，计算超滤量(UV)、D2h肌酐/P2h肌酐、D2h葡萄糖/D0h葡萄糖。方法如下：2.5%葡萄糖PDF 20 ml腹腔注射，取0h透出液1 ml测葡萄糖浓度(D0h葡萄糖)，2h时置入静脉导管放大鼠腹腔内透析液，取1 ml测葡萄糖及肌酐浓度(D2h葡萄糖、D2h肌酐)。乙醚吸入麻醉大鼠，用无菌纱布吸干腹水称重，减去干纱布重量，差额计入总超滤量。UV(ml)=导管排出量+(湿纱布重量-干纱布重量)-20。经下腔静脉取血2 ml测肌酐浓度(P2h肌酐)。

组织病理染色 壁层腹膜组织固定后石蜡包埋，5 μm切片，行HE和Masson染色，计算单位面积血管数及炎症细胞数；腹膜厚度测量参照文献[5]。

免疫组化 链霉亲和素-生物素过氧化物酶复合法进行免疫组化染色，一抗稀释倍数(1∶ 100)。显微镜下随机选8个高倍视野，计数α-SMA,TGF-β1阳性细胞数，利用MetaMorph 6.3 图像分析软件测量Col-Ⅲ面积。

原代大鼠腹膜间皮细胞的分离培养和分组 SD大鼠麻醉后取大网膜；加入0.125%胰酶37℃震荡孵育20 min；离心后弃上清，加入含15%胎牛血清的培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞分组：空白组(细胞培养液)；2.5%葡萄糖PDF组[2.5%葡萄糖PDF：细胞培养液(V/V)=1∶ 1] ；单独H2S组(细胞培养液含300 μmol/L NaHS)；低、高剂量H2S治疗组[2.5%PDF：细胞培养液(V∶ V)=1∶ 1，分别加入NaHS 100 μmol/L、300 μmol/L]。

RT-PCR TRIzol法抽提总RNA，逆转录为cDNA。PCR引物由上海生工合成：MCP-1上游5′-GCAGGTGTCCCAAAGAAG-3′，下游5′-TCAAAGGTGCTGAAGTCC-3′；ICAM-1上游5′-TGGGTCATAATTGTTGGTG-3′，下游5′-CTGAGCCTTCTGTAACTTGTAT-3′；IL-6上游5′-CCTTCTTGGGACTGATGT-3′，下游5′-CTCTGGCTTTGTCTTTCT-3′；α-SMA上游5′-CTCTCCAGCCATCTTTCAT-3′，下游5′-TCATGATGCTGTTATAGGTGGT-3′；E- cadherin上游5′-ACCCGGGACAATGTGTATTACT-3′，下游5′-GCTGGCTCAAATCAAAGTCC-3′；TGF-β1上游5′-CTCCCGTGGCTTCTAGTGC-3′，下游5′-GCCTTAGTTTGGACACGATCTG-3′；β-actin上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3′，下游5′-TAGGAGCCAGGGCAGTA-3′。反应条件：95 ℃预变性5 min；94℃ 30s，54～56℃ 30s，72℃ 30s；72℃延伸5 min,共35个循环。取10 μl PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。应用凝胶成像及图像分析系统分析结果。

统计学分析 以Graphpad Prism 5软件分析数据。计量资料数据以均数±标准差表示，多均数之间两两比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

大鼠腹膜转运功能 与对照组相比，模型组腹膜超滤量显著减少(P<0.05)，D2h肌酐/P2h肌酐显著升高、D2h葡萄糖/D0h葡萄糖显著降低(均P<0.05)；与模型组相比，治疗组超滤量显著增加，D2h肌酐/P2h肌酐下降、D2h葡萄糖/D0h葡萄糖升高，差异均有统计学意义(表1)。

表1 各组大鼠腹膜平衡试验(PET)结果及腹膜组织学检测情况

D2h肌酐/P2h肌酐：2h透析液及血浆肌酐浓度比值；D2h葡萄糖/D0h葡萄糖：2h及0h透析液葡萄糖浓度比值；α-SMA：α平滑肌肌动蛋白；TGF-β1：转化生长因子β1；Col-Ⅲ：胶原蛋白Ⅲ；a：与对照组比较，P<0.05；b：与模型组比较，P<0.05

图1 大鼠壁层腹膜病理改变(HE，×200)对照组(A)和单独H2S组(B)大鼠壁层腹膜表面光滑，可见一层扁平腹膜间皮细胞；模型组(C)腹膜间皮下基质增厚、新生血管增多伴大量炎症细胞浸润；治疗组(D)腹膜间皮下基质变薄，伴新生血管及炎症细胞减少

大鼠壁层腹膜HE染色结果 对照组和单独H2S组大鼠腹膜表面光滑，可见一层扁平腹膜间皮细胞，间皮下基质薄，基质内见脂肪细胞、少许炎症细胞及血管；与对照组相比，模型组大鼠腹膜间皮细胞脱落，间皮下基质显著增厚，新生血管增多伴大量炎症细胞浸润；治疗组上述改变得到显著改善(图1)。炎症细胞和血管计数半定量结果见表1。

大鼠壁层腹膜Masson染色结果 与对照组相比，模型组大鼠腹膜间皮下致密层厚度增加，腹膜明显增厚[(206.60±52.60) μmvs(15.89±4.90) μm，P<0.05]；与模型组相比，治疗组腹膜厚度显著降低[(78.11±9.39) μmvs(206.60±52.60) μm，P<0.05](表1、图2)。

大鼠壁层腹膜α-SMA、Col-Ⅲ及TGF-β1表达情况 α-SMA、Col-Ⅲ及TGF-β1在对照组和单独H2S组大鼠腹膜中仅微弱表达；与对照组相比，模型组大鼠腹膜间皮下α-SMA、TGF-β1阳性细胞数显著增加，Col-Ⅲ表达量也显著增加(均P<0.05)；治疗组大鼠腹膜组织上述蛋白表达量显著低于模型组(均P<0.05)(表1、图3～5)。

图2 大鼠壁层腹膜病理改变(Masson,×100)对照组(A)和单独H2S组(B)大鼠壁层腹膜间皮下仅有少量基质；模型组(C)腹膜间皮下基质增加，腹膜增厚；与模型组相比，治疗组(D)腹膜厚度显著降低

图3 大鼠壁层腹膜α-SMA表达情况(IH,×200)对照组(A)和单独H2S组(B)大鼠壁层腹膜表达少量α-SMA；C:模型组大鼠腹膜间皮下α-SMA阳性细胞数明显增多；D:治疗组大鼠腹膜间皮下α-SMA阳性细胞数较模型组显著减少

图4 大鼠壁层腹膜Col-Ⅲ表达情况(IH,×200)对照组(A)和单独H2S组(B)大鼠壁层腹膜中仅表达少量Col-Ⅲ；C:模型组大鼠腹膜间皮下Col-Ⅲ表达量显著增加；D:治疗组大鼠腹膜组织Col-Ⅲ表达量显著低于模型组

图5 大鼠壁层腹膜TGF-β1表达情况(IH,×200)对照组(A)和单独H2S组(B)大鼠腹膜间皮下可见极少TGF-β1阳性细胞；C:模型组大鼠腹膜间皮下TGF-β1阳性细胞数显著增加；D:治疗组大鼠腹膜间皮下TGF-β1阳性细胞数较模型组显著减少

大鼠腹膜间皮细胞MCP-1、IL-6和细胞间黏附分子1(ICAM-1)mRNA表达情况 与空白组相比，2.5%葡萄糖PDF刺激12 h使腹膜间皮细胞中MCP-1、IL-6和ICAM-1 mRNA表达分别升高(7.71±2.82) 倍、(11.07±4.35)倍和(11.02±0.36)倍(均P<0.01)；在培养液中加入300 μM NaHS再加2.5%葡萄糖PDF刺激，与2.5%葡萄糖PDF组相比，MCP-1、IL-6和ICAM-1 mRNA表达分别下降(49.64%±4.39%)、(80.84%±10.21%)和(58.44%±8.96%)，差异均有统计学意义(图6)。

大鼠腹膜间皮细胞α-SMA、E-cadherin和TGF-β1 mRNA表达情况 与空白组相比，2.5%葡萄糖PDF刺激12h使腹膜间皮细胞中α-SMA、TGF-β1 mRNA表达分别升高(1.96±0.89) 倍和(7.57±1.99) 倍，E-cadherin mRNA表达下降(91.53%±1.05%)，差异均有统计学意义；在培养液中加入NaHS 300 μmol/L再用2.5%葡萄糖PDF刺激,与2.5%葡萄糖PDF组相比，α-SMA、TGF-β1 mRNA表达分别下降(49.52%±9.38%)和(62.46%±7.98%)，E-cadherin mRNA表达增加(7.73±1.37)倍(均P<0.01)(图6)。

图6 腹膜间皮细胞MCP-1、ICAM-1、IL-6、α-SMA、E-cadherin和TGF-β1 mRNA表达MCP-1：单核细胞趋化蛋白1；ICAM-1：细胞间黏附分子1；IL-6：白细胞介素6；α-SMA：α平滑肌肌动蛋白；E-cadherin ：E钙黏素；TGF-β1：转化生长因子β1；2.5%PDF：2.5%腹膜透析液；NaHS：硫氢化钠；**：与空白组比较，P<0.01；##：与2.5%PDF组比较，P<0.01

讨 论

内源性H2S存在于多种哺乳动物体内并发挥重要作用。在肝硬化、肺纤维化、肾间质纤维过程中，常伴内源性H2S水平偏低，适量补充外源性H2S，可显著改善器官纤维化[1,3,6]。然而，PDF中加入适量H2S能否改善PD所致的腹膜纤维化尚未见报道，故本研究旨在观察在PDF中添加外源性H2S能否减轻腹膜纤维化，并在细胞水平探讨其机制。我们前期研究发现NaHS治疗肾脏纤维化的最佳剂量为56 μg/(kg·d)，560 μg/(kg·d)时具有毒性[1]。故本研究中大鼠NaHS剂量采用56 μg/(kg·d)，此剂量产生的H2S浓度在大鼠生理浓度范围内[1,7]。文献报道，NaHS作用于细胞的浓度为25～500 μmol/L[8-9]，我们预实验结果显示浓度超过500 μmol/L对细胞具有毒性。故本研究选择100 μmol/L和300 μmol/L NaHS作用于腹膜间皮细胞。

本研究发现，模型组大鼠腹膜表面间皮细胞脱落，间皮下基质增厚伴新生血管增多和炎症细胞浸润增多，且超滤量显著减少，与既往研究相符[10]。而予模型组大鼠腹腔注射NaHS[56 μg/(kg·d)]能明显降低腹膜厚度，减少血管增生及炎症细胞浸润，伴腹膜通透性降低、超滤量显著增加，提示腹膜结构及功能均明显改善。既往研究表明，TGF-β1可引起腹膜间皮下新生血管增多、α-SMA表达增多及腹膜通透性增加[11]。本研究发现，模型组大鼠腹膜间皮下TGF-β1表达明显增多，α-SMA、Col-Ⅲ等细胞外基质成分聚集；予NaHS干预后，腹膜间皮下TGF-β1表达降低，细胞外基质成分显著减少，再次证实外源性H2S对改善PDF诱导的腹膜结构和功能损伤有益，具有抗腹膜纤维化作用。

腹膜间皮细胞转分化(EMT)直接参与腹膜纤维化[11-12]。高糖刺激下，腹膜间皮细胞分泌大量TGF-β1和炎症因子，促使间皮细胞转分化，即细胞失去典型上皮细胞骨架，上皮细胞标志蛋白(如E-cadherin)表达减少，成纤维细胞标志蛋白(如α-SMA)表达增多，并分泌大量细胞外基质[13-14]。与既往研究相符[13-14]，本研究发现，高糖PDF使腹膜间皮细胞TGF-β1及炎症因子表达显著增多，同时伴E-cadherin表达减少、α-SMA表达增加，提示在此过程中腹膜间皮细胞发生了转分化；而给予NaHS干预，TGF-β1表达明显减少，并能抑制E-cadherin表达减少和α-SMA表达增加，提示外源性H2S能通过抑制腹膜间皮细胞转分化而发挥抗纤维化作用。

炎症是诱导细胞转分化的重要使动因素，也是腹膜纤维化的上游事件[15-16]。在急性肺损伤模型中，H2S明显抑制肺内中性粒细胞聚集，降低血浆和肺组织中IL-8和IL-6水平，增加IL-10水平[17]。哮喘大鼠的肺组织中内源性H2S浓度、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathio nine γ-lyase,CSE)活性及蛋白表达降低；给予NaHS 后支气管肺泡灌洗液中细胞总数、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞均减少[18]。外源性H2S可下调脑组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和MCP-1表达，上调IL-10，减轻脑组织炎症损伤[19]。GYY4137(一种新型H2S外源性供体)可减少细胞促炎症因子产生，增强抗炎物质分泌，保护机体免受内毒素血症[20]。本研究发现，高糖PDF刺激后，腹膜间皮细胞分泌大量炎症因子(如MCP-1等)，NaHS可显著抑制腹膜间皮细胞合成以上炎症因子，提示H2S抗腹膜纤维化作用与其抗炎作用有关。

综上所述，适当浓度外源性H2S可减轻高糖PDF对大鼠腹膜结构及功能的损伤，改善腹膜纤维化，初步研究结果认为其保护作用与抗炎、抑制腹膜间皮细胞转分化有关，但其涉及的具体信号通路及分子机制仍有待进一步研究探明。

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(本文编辑 青 松)

Effects of exogenous H2S on peritoneal morphological and functional damages in a rat model of peritoneal dialysis

LUYing,GAOLuyan,SONGKai,WANGZhi,SHENHuaying

DepartmentofNephrology,SecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215004,China

SHENHuaying(E-mail:shenhy513@sina.com)

Objective：To investigate the effect of exogenous hydrogen sulfide (H2S) on peritoneal morphological and functional damages in a rat model of peritoneal dialysis (PD). Methodology：A model of peritoneal fibrosis was established by intraperitoneally injecting 4.25%-glucose peritoneal dialysis fluids (PDFs) and lipopolysaccharide (LPS) to Sprague-Dawley rats. And rats

daily intraperitoneal injections of NaHS (56 μg/kg), an H2S donor. After 28 days, peritoneal equilibration test (PET) was used to assess peritoneal function. Hematoxylin and eosin and Masson-trichrome staining were performed to observe pathological changes of parietal peritoneum. Immunohistochemical staining was used to detect α-smooth muscle actin (α-SMA), type III collagen (Col-Ⅲ) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1). Synchronized confluent rat peritoneal mesothelial cells (PMCs) were incubated with 2.5%-glucose PDFs with or without NaHS. The level of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1)、interleukin-6 (IL-6)、intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1)、α-SMA、E-cadherin and TGF-β1 mRNA produced by PMCs were detected by RT-PCR. Results： Compared with the control group, parietal peritoneum of the model rats under light microscopy exhibited thicker collagen accumulation, more neoangiogenesis and inflammatory cells infiltration (P<0.05). The expressions of Col-Ⅲ, α-SMA and TGF-β1 were significantly increased in the fibrotic peritoneum (P<0.05). Moreover, ultrafiltration volume (UV) of the PD model group was significantly decreased, while a higher peritoneal permeability reflected as a decrease of the D2/D0 glucose and an increase of the D2/P2 creatinine ratio (P<0.05). By contrast, administration of NaHS to the model rats, markedly decreased the inflammatory cells infiltration, neoangiogenesis and the biomarkers of fibrosis in the peritoneum (P<0.05), paralleled by reduced peritoneal permeability and increased ultrafiltration capacity (P<0.05). In cell culture experiments, exposure of rat PMCs to 2.5%-glucose PDFs for 12 hours resulted in a significantly upregulated expression of MCP-1, IL-6, ICAM-1 and TGF-β1 mRNA, which were attenuated by NaHS (P<0.01). Moreover, treatment with NaHS prevented 2.5%-glucose PDFs-induced upregulated expression ofα-SMA and downgulated expression of E-cadherin in rat PMCs (P<0.01). Conclusion：These findings suggest that, exogenous H2S is able to ameliorate peritoneal fibrosis and improve peritoneal transport function.

peritoneal dialysis hydrogen sulfide peritoneal fibrosis epithelial-mesenchymal transition

10.3969/j.issn.1006-298X.2017.04.008

国家自然科学基金(青年科学基金)(81400762);苏州市科技计划项目基金(应用基础研究)(SYS201469)

苏州大学附属第二医院肾内科(苏州，215004)

沈华英(E-mail：shenhy513@sina.com )

2016-11-21

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