高表达Foxp3的肺癌细胞抑制人CD4+T细胞免疫活性①

刘瑞敏 张爱红 晁玮霞 孙丹妮 王明丽 马远方 白慧玲

(抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室，河南大学基础医学院，开封475000)

高表达Foxp3的肺癌细胞抑制人CD4+T细胞免疫活性①

刘瑞敏 张爱红 晁玮霞 孙丹妮 王明丽 马远方 白慧玲

(抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室，河南大学基础医学院，开封475000)

目的：研究高表达转录因子Foxp3的肺癌细胞对CD4+T淋巴细胞的作用。方法：利用脂质体转染法建立稳定高表达Foxp3的NCIH- hFoxp3肺癌细胞株，荧光定量PCR和Western blot检测细胞Foxp3的表达；ELISA法检测NCIH- hFoxp3培养上清中IL- 8、IL- 10表达量的变化；分离并活化CD4+T淋巴细胞，用含20%NCIH- hFoxp3肿瘤上清的培养基培养，检测CD4+T淋巴细胞IL- 2表达量的变化；将NCIH- hFoxp3与活化的CD4+T淋巴细胞共培养，MTT评价免疫效应细胞增殖情况；免疫细胞化学法观察NCIH- hFoxp3细胞对活化CD4+T淋巴细胞黏附作用的抑制。结果：建立高表达Foxp3的NCIH- hFoxp3肺癌细胞株，与阴性对照相比，NCIH- hFoxp3细胞培养上清IL- 8表达量降低，IL- 10表达量升高，NCIH- hFoxp3肿瘤细胞能抑制活化的CD4+T淋巴细胞IL- 2的表达、增殖及浸润。结论：肺癌细胞Foxp3的表达对活化的CD4+T淋巴细胞有免疫抑制作用，这可能与NCIH- hFoxp3分泌细胞因子IL- 8表达量降低，IL- 10表达量升高有关。

Foxp3；肺癌；IL- 8；IL- 10；CD4+T淋巴细胞；免疫活性

机体免疫系统可以通过免疫监视作用识别、控制最终消灭肿瘤细胞，而肿瘤细胞可通过多种机制逃逸免疫系统的监视而生存。肿瘤细胞能否逃逸免疫监视是影响肿瘤形成和发展的主要原因。调节性T淋巴细胞(Treg)在机体免疫监视过程中发挥重要的作用，转录因子Foxp3是Treg 的标志性分子之一，对Treg细胞的发育及功能发挥起着关键的作用[1]。

Treg细胞与肿瘤的发生及转移有密切关系。在人结肠癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等肿瘤组织内都发现了高比率的Treg细胞，在子宫颈癌，其转移的淋巴结内发现有较高比率的Treg细胞[2]。在小鼠肿瘤模型中，肿瘤部位也具有很高比率的Treg细胞，用抗CD25的抗体预先处理小鼠，肿瘤细胞则被排斥，肿瘤不会形成[3]。这些研究结果说明，可能正是肿瘤组织存在和聚集的Treg细胞抑制了免疫功能，使肿瘤细胞发生免疫逃逸形成肿瘤。最近研究发现，一些高表达Foxp3的肿瘤具有类似于Treg细胞的免疫抑制作用。我们建立高表达Foxp3的肺癌细胞株，探讨高表达Fox3的肺癌细胞以何种方式和途径影响活化的CD4+T细胞的免疫功能，为肿瘤的治疗和预防提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 肺癌细胞NCIH- 1299来自本实验室，pcDNA3- hFoxp3质粒和pcDNA3对照质粒由田文志教授馈赠。SYBR Green荧光定量PCRmix购自北京康为公司，鼠抗人Foxp3 单克隆抗体购自Abcam公司，人IL- 8、IL- 10的ELISA试剂盒、鼠抗人CD3单克隆抗体、鼠抗人CD28单克隆抗体购自武汉博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1 脂质体转染法转染并筛选稳定高表达Foxp3的肺癌细胞株 转染步骤按照Invitrogen公司Lipofectamine 2000试剂盒的说明书。用G418筛选转染后的细胞，浓度为1 000 mg/L，用有限稀释法挑选扩增稳定高表达Foxp3的细胞株，命名为NCIH- hFoxp3。

1.2.2 荧光定量PCR、Western blot方法验证转染效果 取NCIH- hFoxp3及对照细胞，Trizol法提取RNA，按照逆转录试剂盒操作说明将获得的RNA转录成cDNA。荧光定量扩增Foxp3目的片段，上游引物5′- TTCTTCCTTGAACCCCATGC- 3′ ；下游引物5′- CTGGAGGAGTGCCTGTAAGT- 3′，产物为118 bp。β- actin为内参:上游引物5′- CCTAGAAGCATTTGCG- GTGG- 3′；下游引物5′- GAGCTACGAGCTGCCTGA- CG- 3′，产物为220 bp。用荧光定量PCR仪所配软件Rotor- Gene 6000 Series Software对实验结果进行分析。取NCIH- hFoxp3及对照组细胞提取蛋白做SDS- PAGE凝胶电泳，电泳后转移至PVDF膜上，加鼠抗人Foxp3抗体4℃过夜，加山羊抗鼠二抗，暗室显影，用β- actin为内参比较。

1.2.3 ELISA检测NCIH- hFoxp3和对照组细胞培养上清中IL- 8、IL- 10的表达差异 把对数增长期的细胞接种到6孔板中，设3个复孔。在培养24、36、48 h后收集细胞的培养上清，低温离心5 min后冻存。按照ELISA试剂盒的操作步骤检测细胞IL- 8、IL- 10的表达量，实验重复3次。

1.2.4 分离并活化CD4+T细胞 无菌抽取健康人外周血30 ml，密度梯度离心法分离单个核细胞，利用MACS磁性分离柱分离出CD4+T淋巴细胞。使用抗CD3和抗CD28抗体刺激分离的CD4+T淋巴细胞，方法为用抗CD3抗体2 μg/ml包被6孔板12 h，再加CD4+T淋巴细胞和抗CD28抗体2 μg/ml，刺激3 d。

1.2.5 ELISA方法检测活化的CD4+T淋巴细胞用NCIH- hFoxp3和对照细胞上清培养后IL- 2表达量的变化 将NCIH- hFoxp3和对照组肺癌细胞按照相同数目接种，待细胞长至80%融合时，用PBS洗涤6次，改为无血清培养基培养12 h，取培养上清备用。活化的CD4+T细胞用加入含20%肿瘤细胞上清的培养基培养，分别在培养4、8、12、24 h时收集细胞培养上清，离心5 min。按照人ELISA试剂盒说明书的操作步骤检测IL- 2表达量。

1.2.6 免疫细胞化学方法观察NCIH- hFoxp3和对照组细胞对活化的CD4+T淋巴细胞黏附的抑制作用 把两种肺癌细胞以相同的数目接种到6孔板中的盖玻片上，加入活化的CD4+T细胞，CD4+T细胞NCIH- hFoxp3和对照组细胞的比例为5∶1，设3个复孔。培养6 h后，取出细胞爬片，进行免疫细胞化学染色。用PBS冲洗爬片3次，95%酒精固定 10 min，滴加鼠抗人Foxp3抗体孵育4℃ 过夜。山羊抗鼠二抗孵育37℃ 30 min，滴加DAB显色液显色约3～10 min，中性树胶封片。

1.2.7 共培养系统对 CD4+T 细胞增殖的影响 将磁珠分离的 CD4+T 细胞活化增殖 3 d 后调整浓度为1×105ml-1。与肺癌细胞NCIH- hFoxp3按1∶1的比例共同培养，共培养系统采用24孔Transwell 细胞共培养板，NCIH- hFoxp3在上室，T细胞在下室，用 10%血清的1640培养基，72 h 后收集下室T细胞，细胞吹打均匀后接种于96孔培养板，每孔100 μl，设3个复孔，每孔加人MTT 10 μl，孵育4 h，然后加入DMSO 100 μl，继续孵育2 h，用全自动酶标仪测492 nm处吸光度(A值)。

2 结果

2.1 建立稳定高表达Foxp3的细胞株NCIH- hFoxp3 荧光定量PCR的结果如图1:荧光定量法对NCIH- hFoxp3及对照细胞进行Foxp3基因扩增，重复3次，2-ΔΔCT值均在4以上，差异具有统计学意义。Western blot结果如图2: NCIH- hFoxp3细胞在48 kD大小的位置出现明显的条带，而NCIH- 1299细胞和空白质粒对照细胞在48 kD大小的位置没有出现明显的条带，表明pcDNA3- hFoxp3质粒转染到NCIH- 1299细胞中，在蛋白水平上高表达，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.2 NCIH- hFoxp3和对照细胞培养上清IL- 8、IL- 10表达差异 用ELISA方法检测在不同的时间点细胞培养上清中IL- 8、IL- 10表达量的差异，结果如图3:两组细胞上清中IL- 8的含量都随着培养时间的增加而增加； NCIH- hFoxp3细胞组中IL- 8的含量明显低于对照组，两组的差异有统计学意义(t24 h=76.72、t36 h=34.01、t48 h=43.76，P<0.01)。图4所示，NCIH- hFoxp3细胞组上清中IL- 10的含量随时间的增加有明显升高，在36 h后含量高于对照组，36 h后两组的差异有统计学意义(t36 h=9.40，P<0.05；t48 h=23.93，P<0.01)。

2.3 活化的T淋巴细胞用NCIH- hFoxp3和对照细胞上清培养后IL- 2表达量变化 活化的T细胞用含20%肿瘤细胞上清的培养基培养，在培养4、8、12、24 h时收集培养上清检测IL- 2的浓度。结果如图5所示: hFoxp3上清培养组T细胞IL- 2的表达量随培养时间的增长而下降，NCIH- control上清培养组T细胞IL- 2的表达量先上升，培养8 h后逐渐下降。在各个时间点NCIH- hFoxp3上清培养组T细胞IL- 2的表达量都明显低于对照组，差异具有统计学意义(t4 h=16.50、t8 h=61.33、t12 h=6.87、t24 h=12.39,P<0.05)。

图1 高表达Foxp3的细胞株NCIH- hFoxp3的PCR鉴定Fig.1 Identification of NCIH- hFoxp3 by quantitative PCRNote: Vs NCIH- control，**.P<0.01.

图2 高表达Foxp3的细胞株NCIH- hFoxp3的Western blot图及统计学分析图Fig.2 Identification of NCIH- hFoxp3 by Western blotNote: Vs NCIH- control，**.P<0.01.

图3 两组细胞培养上清不同时间IL- 8含量对比Fig.3 Concentration of IL- 8 in tumor cells supernatants at different timeNote: Vs NCIH- control，**.P<0.01.

图4 两组细胞培养上清不同时间IL- 10含量对比Fig.4 Concentration of IL- 10 in the tumor cells superna- tants at different time Note: Vs control，*.P<0.05,**.P<0.01.

图5 T细胞与两组细胞培养上清共培养后T细胞IL- 2表达量的变化Fig.5 Concentration of IL- 2 of CD4+T cells in superna- tants after culturing with tumor supernatants at different timeNote: Vs.NCIH- control，*.P<0.05.

图6 NCIH- hFoxp3和对照组细胞对活化CD4+T淋巴细胞黏附作用的抑制Fig.6 Inhibiting of CD4+T cells to adhesion to NCIH- hFoxp3 and control cells

表1 活化的CD4+T细胞周围黏附的NCIH- hFoxp3和对照细胞比较

Tab.1 To contrast the numbers of NCIH- hFoxp3 and control cells around active CD4+T cells

GroupsTumorcellsCD4+TcellsCD4+Tcells/tumorcellsNCIH-hFoxp356.4±6.487.4±1.920.129±0.0251)NCIH-control32.9±4.8447.2±8.891.439±0.209

Note：1)P<0.01 vs NCIH- control.

图7 NCIH- hFoxp3和对照组细胞对 CD4+T 细胞增殖的影响Fig.7 Effects of NCIH- hFoxp3 and NCIH- control on CD4+T cells proliferating

2.4 NCIH- hFoxp3和对照组细胞对活化CD4+T淋巴细胞黏附作用的抑制 结果如图6、表1所示:与 NCIH- control组肿瘤细胞周围聚集的T细胞相比，NCIH- hFoxp3组肿瘤细胞周围聚集的T细胞明显减少。随机取5个视野，分别计算视野中的肿瘤细胞和T细胞的个数。NCIH- hFoxp3组平均1个肿瘤细胞周围有0.129个T淋巴细胞，NCIH- control组平均1个肿瘤细胞周围有1.439个T细胞，两组的差异具有统计学意义。

2.5 共培养系统对 CD4+T 细胞增殖的影响 NCIH- hFoxp3和对照组分别与CD4+T细胞共培养的MTT结果如图7所示，在共培养系统中，与对照组相比，NCIH- hFoxp3肺癌细胞能抑制效应性 CD4+T 细胞增殖，这种抑制增殖能力不依赖细胞接触，差异具有统计学意义(t=7.69，P<0.01)。

3 讨论

肿瘤形成及转移是多阶段连续的复杂过程，受多种因素的影响，肿瘤细胞能否逃逸免疫监视是影响肿瘤形成的主要原因之一。Treg细胞在机体的免疫监视过程中发挥重要的作用，Foxp3主要在Treg表达，是Treg的标志性分子，主要通过维持Treg发育发挥作用[4]。Treg 细胞可通过分泌免疫抑制因子IL- 10及IL- 35发挥其调节功能[5]，如IL- 10抑制效应T细胞的活性，而IL- 35则具有抑制T细胞的增殖等。Treg细胞的确与肿瘤的发生及转移有密切关系。在多种肿瘤组织内都发现了高比率的Treg细胞，而且在非小细胞肺癌、胃癌均发现Treg细胞与肿瘤的侵袭与转移呈正相关[6- 9]。这些研究结果说明，可能肿瘤组织存在和聚集的Treg细胞，使肿瘤细胞免疫逃逸。

Treg在肿瘤免疫逃逸中具有重要作用，而Treg发育和免疫抑制作用主要受Foxp3的调控。最近研究发现，一些高表达Foxp3的肿瘤具有类似于Treg细胞的免疫抑制作用，如人神经胶质瘤细胞抑制T细胞增殖等[10]。高表达Foxp3的肿瘤细胞对活化的CD4+T淋巴细胞免疫活性的影响的报道较少。本实验的目的是观察高表达Foxp3的肺癌细胞株对活化CD4+T淋巴细胞的作用，更符合肿瘤免疫的过程。实验中，我们测定了活化的CD4+T淋巴细胞用NCIH- hFoxp3和对照细胞上清培养后IL- 2表达量的变化，发现NCIH- hFoxp3上清培养组的CD4+T淋巴细胞IL- 2的表达量明显低于NCIH- control上清培养组，NCIH- hFoxp3和对照组分别与CD4+T细胞共培养的MTT显示，在共培养系统中NCIH- hFoxp3肺癌细胞能抑制效应性 CD4+T 细胞增殖，这种抑制增殖能力不依赖细胞接触，差异具有统计学意义(P<0.05)。以上实验结果提示高表达Foxp3的肺癌细胞可以抑制活化的CD4+T细胞的增殖及活性，IL- 2在CD4+T细胞的增殖中发挥重要作用[11]。

本实验用ELISA方法检测了肺癌细胞株NCIH- hFoxp3和对照细胞上清中IL- 8、IL- 10和TGF- β的表达，发现NCIH- hFoxp3组细胞上清中IL- 8明显降低，IL- 10明显升高，而TGF- β的分泌量差异无统计学意义(实验结果中未列出)。IL- 10是一种重要的参与免疫负调控的细胞因子，能抑制CD4+T细胞向Th1细胞分化，从而抑制Th1细胞对CD8+T细胞免疫的辅助作用[12]。而机体的抗肿瘤免疫，以效应CD8+T细胞免疫应答为主，高表达Foxp3的肿瘤细胞可能通过这种方式逃逸机体的免疫监视作用，这和CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞的调节作用相似。

我们用免疫细胞化学染色对活化的CD4+T细胞和两组肺癌细胞共同培养时细胞的浸润进行统计，在NCIH- hFoxp3细胞周围浸润的T淋巴细胞明显少于对照组，NCIH- hFoxp3可以通过直接接触抑制CD4+T细胞的作用。

本实验还发现NCIH- hFoxp3细胞表达IL- 8低于对照组细胞。IL- 8对特异性和非特异性的免疫细胞具有强烈的趋化作用，包括对嗜中性粒细胞的趋化和激活作用及对淋巴细胞和嗜碱性粒细胞的趋化作用。有研究者发现表达Foxp3的肿瘤细胞表现出和CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞相似的特性，即可抑制CD4+CD25-T 细胞的增殖，用Foxp3 siRNA抑制肿瘤细胞Foxp3表达后，肿瘤细胞分泌的IL- 8增高[13]，同我们的研究结果一致。而大量研究表明，在肿瘤组织中Foxp3高表达的患者预后不良[14]，所以我们推测，肿瘤局部IL- 8低表达，对免疫细胞趋化作用减弱，抑制了免疫细胞的浸润，这也是肿瘤细胞逃逸免疫杀伤的机制之一。

综上所述，我们得出结论，高表达Foxp3的肺癌细胞抑制了T细胞的浸润能力及活化的T细胞的免疫作用，这可能是通过调节细胞因子IL- 8和IL- 10的分泌而实现的。

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[收稿2016- 11- 21 修回2017- 03- 07]

(编辑 倪 鹏)

Foxp3 overexpression in lung cancer cells suppresses immune activities of activa- ted CD4+T cells

LIU Rui- Min，ZHANG Ai- Hong，CHAO Wei- Xia,SUN Dan- Ni,WANG Ming- Li,MA Yuan- Fang，BAI Hui- Ling.

Joint National Laboratory for Antibody Drug Engineering,Medical College of Henan University,Kaifeng 475000,China

Objective:To determine the effects of Foxp3- overexpressing lung cancer cells on activated CD4+T lymphocyte.Methods: Stable Foxp3- overexpressing lung cancer cells NCIH- 1299,NCIH- hFoxp3,was generated by transfection of NCIH- 1299 cells with plasmid pcDNA3- hFoxp3 mediated by Lipofectamine 2000 and by selection with G418,and validated by quantitative PCR and Western blot.The expression levels of IL- 8 and IL- 10 secreted by NCIH- hFoxp3 and NCIH- control were measured by ELISA.IL- 2 secrection by activated human CD4+T lymphocyte which was tested after stimulation with 20% conditioned medium of NCIH- hFoxp3 and NCIH- control cells.The proliferation of activated human CD4+T lymphocytes was assessed by MTT after coculture with NCIH- hFoxp3 cells.The adhesive ability of activated human CD4+T lymphocytes was probed with NCIH- hFoxp3 cells by immunocytochemistry.Results: Compared with NCIH- control cells,NCIH- hFoxp3 secreted high level of IL- 10 and low level of IL- 8.NCIH- hFoxp3 with Foxp3 overexpression significantly suppressed the proliferation,adhesive potential and IL- 2 expression by activated CD4+T cells.Conclusion: Suppression of immune activities of activated CD4+T cells by Foxp3 overexpression in lung cancer cells may correlate with cytokine IL- 8 and IL- 10,which can contribute lung cancer progression.

Foxp3;Lung cancer;IL- 8;IL- 10;CD4+T lymphocyte;Immune activities

10.3969/j.issn.1000- 484X.2017.08.004

刘瑞敏(1974年-)，女，硕士，副教授，主要从事肿瘤免疫方面的研究。

及指导教师：白慧玲(1964年-)，女，硕士，教授，硕士生导师，主要从事自身免疫性疾病及肿瘤免疫方面的研究，E- mail:445950688@qq.com。

R730.3

A

1000- 484X(2017)08- 1141- 05

①本文为河南省卫生厅2010医学科技攻关计划(2010003083)。