猪繁殖与呼吸综合征LAMP检测方法建立

赵相鹏汪琳*尹羿蒲静任彤高志强张伟刘凤华史雅然

（1.北京出入境检验检疫局 北京 100026；2.北京农学院）

猪繁殖与呼吸综合征LAMP检测方法建立

赵相鹏1汪琳1*尹羿1蒲静1任彤1高志强1张伟1刘凤华2史雅然2

（1.北京出入境检验检疫局 北京 100026；2.北京农学院）

以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF6基因为靶基因，设计2对引物，建立PRRSV RT-LAMP检测方法。该检测方法的灵敏度与荧光RT-PCR检测方法相近，高于普通RT-PCR检测方法，约2 h即可得出结果，不需要昂贵的仪器设备，适于猪场PRRSV的监测。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；RT-LAMP

1 前言

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），曾称“猪蓝耳病”“猪瘟疫”“猪流行性流产和呼吸综合征”等，由猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）引起，其以妊娠母猪流产、早产、产死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪和肥育猪的呼吸道症状为特征[1，2]，我国将其列为二类传染病。PRRS病毒（PRRSV）是一种单股正链的RNA病毒，基因组长约15 kb，具有9个开放阅读框架（ORFs）。常用的分子生物学检测方法为普通RTPCR和荧光RT-PCR，其中荧光RT-PCR是国际上公认的快速准确技术之一，但设备昂贵[3-7]，很多基层养猪场无法购买。环介导等温扩增技术（LAMP）不需要模板热变性[8，9]，仅需普通水浴锅就能完成[10]。本项目针对美洲型PRRSV建立了RT-LAMP检测技术，通过特异性、灵敏度实验和临床样本检测，表明RT-LAMP检测方法的灵敏度与荧光RT-PCR方法相当，扩增效率高，特异性强，结果判定简单，适合基层现场快速检测。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试剂

TRIZOL：购自Invitrogen公司；AMV反转录酶、dNTP：购自Promega公司；Bst DNA 聚合酶：购自NEB公司；Betaine：购自Sigma公司；SYBR Green I： 购自 Invitrogen 公司；HNB（Hydroxynaphthol blue）：分子式 C20H11N2Na3O11S3，M＝620.47 g/Mol，购自Fluka公司；Taq DNA聚合酶和PCR相关试剂：购自Promega公司；PRRS病毒美洲型荧光RT-PCR检测试剂盒：实验室研制；RNA酶抑制剂：购自Promega公司；Trizol裂解液：购自Ambion公司；氯仿、无水乙醇：均为分析纯，购自国药集团；75%乙醇，用新开启的分析纯无水乙醇和DEPC水（符合GB 6682-92要求）配制，-20℃预冷。

2.1.2 主要仪器

台式冷冻高速离心机：Eppendorf 5417R，离心速度可达12 000 r/min；台式电子天平：IKA RCT basic；常规PCR仪：ABI 9700；荧光PCR检测仪：ABI 7900HT，Roche 1.1。

2.1.3 灭活病毒及核酸

研究过程中应用到的病毒株有灭活的美洲型PRRSV VR2332、灭活美洲型PRRSV 07-45株、灭活高致病性PRRSV 07-14株、灭活高致病性PRRSV 07-14株、灭活欧洲型PRRSV LV、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒C株核酸和猪链球菌2型ZY株核酸：均由本实验室保存。

2.2 方法

2.2.1 病毒RNA的提取

向加有600 μL裂解液的灭菌离心管中加入待测样本200μL，用吸头反复吸打混匀；再加入200 μL氯仿，混匀器上振荡混匀5 s（不宜过于强烈，以免产生乳化层），离心（12 000 g，15 min）；另取灭菌离心管，加入 600 μL 异丙醇（-20℃预冷），并加入上述离心后的上层液相（注意不要吸出中间层，该层富含DNA和蛋白质），颠倒混匀，离心（12 000 g，15 min）；轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体；加入600 μL 75%乙醇（-20℃预冷），颠倒洗涤，离心（12 000 g，10 min）；轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，尽量吸干液体；10 000 g离心5 s，将管底部少量液体用微量加样器吸干，室温干燥5 min；于干燥后的沉淀中加入11 μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA（即为所需 RNA）。

2.2.2 引物的设计

为确保探针的保守性和特异性，针对目前已知的3个不同亚群的PRRSV核酸[11]，选取ORF6基因编码区特定序列作为靶区域，应用DNA MAN在多重序列比对的基础上，进行引物设计（见图1）。引物FIP和BIP针对的2个扩增区域之间用TTTT进行连接，以便于扩增时成环。

图1 PRRSV美洲型3个不同亚群的的序列比对和引物设计

2.2.3 引物的筛选

对引物进行筛选试验。RT-PCR引物为P1和P2，扩增片段为236 bp；LAMP引物为：PRRS1-F3、PRRS1-B3、PRRS1-FIP、PRRS1-BIP、PRRS2-F3、PRRS2-B3、PRRS2-FIP、PRRS2-BIP。

2.2.4 RT-LAMP反应体系的建立与优化

MgSO4、betaine、dNTP 的浓度以及反应时间和温度对LAMP反应效率有一定影响，通过逐一优化，确定反应体系和条件（表1），以期达到最佳扩增效率。

PRRSV美洲型07-14提取RNA后，将RNA 1∶104稀释后，进行RT-LAMP检测，反应参数为60℃/60 min，80℃/15 min。

表1 RT-LAMP反应体系

2.2.5 灵敏度试验

将PRRSV 07-14核酸作10-1-10-8倍稀释，分别用RT-LAMP、普通RT-PCR和荧光RT-PCR检测，比较方法的灵敏度。

2.2.6 特异性试验

用所建立的RT-LAMP方法对欧洲型PRRSV LV核酸、猪伪狂犬病病毒核酸、猪瘟病毒C株核酸、猪链球菌2型ZY株核酸分别进行检测，以验证方法的特异性。

2.2.7 重复性试验

连续3次分别用建立的RT-LAMP方法对病毒07-14核酸的 10-5、10-6、10-7稀释液进行重复性试验，以验证方法的可重复性和稳定性。

2.2.8 快速显色研究

在建立RT-LAMP检测方法的基础上，分别将SYBR Green I和HNB两种染色液加入反应体系，比较显色情况。SYBR Green I购买后直接使用；HNB为粉末，称量0.946 g，用DEPC水定容于50 mL离心管中。取6支1.5 mL离心管，每管加入900 μL DEPC水，再分别加入100 μL 30 mmol/L HNB，配成3 mmol/L HNB溶液。

2.2.9 对临床样品的检测

某地区数个规模化猪场采集的病料 （各种内脏和肌肉组织）49份，用建立的RT-LAMP方法进行检测，并与荧光RT-PCR和常规RT-PCR检测方法进行比较。

3 结果

3.1 引物筛选结果

采用上述条件，筛选出能检出所用3株美洲型病毒核酸，且扩增稳定的引物对，即PRRS2-F3、PRRS2-B3、PRRS2-FIP、PRRS2-BIP（图 2）。

图2 引物筛选试验结果

3.2 灵敏度试验结果

用建立的RT-LAMP检测PRRSV 07-14核酸10-1-10-8稀释液，结果显示该方法的灵敏度达到10-8（图3-图4）。用建立的方法与荧光定量RT-PCR方法和常规RT-PCR方法进行比较，结果见图5。

图3RT-LAMP对PRRSV 07-14核酸检测灵敏度

图4 加入SYBR Green I进行染色的结果

图5 RT-LAMP与荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR的比较

图5显示，建立的方法灵敏度与荧光定量RTPCR方法相近，但明显高于常规RT-PCR检测方法。

3.3 特异性试验结果

试验结果显示特异性良好，无交叉反应（图6）。

图6 RT-LAMP的特异性试验结果

3.4 重复性试验结果

试验结果显示，3个稀释度的病毒核酸均为阳性，重复性好。

3.5 快速显色研究

结果显示，SYBR Green I在反应前加入反应体系会影响扩增结果，且显色明显程度不如HNB；而HNB在反应前加入反应体系不影响扩增效果（图7）。

图7 HNB染色结果

3.6 临床样品检测结果

49份病料用建立的RT-LAMP方法进行检测，并与荧光RT-PCR和常规RT-PCR检测方法进行比较，结果见表2。结果显示RT-LAMP与荧光RTPCR结果完全一致，符合率100%，阳性检出率高于普通RT-PCR。

表2 49份临床样品的检测结果

4 结论

本项目建立的LAMP检测方法特异性良好，与猪瘟病毒核酸、猪伪狂犬病毒核酸以及猪链球菌2型核酸无交叉反应。临床样本检测显示RT-LAMP检测方法的灵敏度与荧光RT-PCR一致，完全可用于养殖场现场快速检测、诊断PRRSV。实验中还发现LAMP由于产物量大，开盖检测很容易发生气溶胶污染，因此在反应前加入显色剂，反应结束后不开盖就能判读结果，有利于检测质量控制。

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LAMP Detection Method for PRRSV

ZHAO Xiangpeng1， WANG Lin1*， YIN Yi1， PU Jing1， REN Tong1， GAO Zhiqiang1，ZHANG Wei1， LIU Fenghua2， SHI Yaran2
（1.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Beijing， 100026；2.Beijing Agricultural College）

The porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） RT-LAMP detection method was built.ORF6 gene of PRRSV is as the target gene，and 2 pairs of primers were designed.The sensitivity is equal as fluorescent RT-PCR detection method，more sensitivity than the common RT-PCR method.The result can be get in about 2 hours，and the expensive instrument isn't necessary.The LAMP detection method is suitable for the PRRS virus in farm.

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome；LAMP

S851.34；Q789

E-mail：zhaoxp@bjciq.gov.cn；*通讯作者E-mail：wanglin@bjciq.gov.cn

北京市科技计划课题 （D171100002117002）

2017-01-21