焦磷酸测序快速检测3种海洋性弧菌的方法学建立及创伤弧菌16S rRNA基因分型的研究

张丽娜，郑妍，胡成进，周月霞，陈英剑

(1.济南军区总医院实验诊断科，济南 250031；2.青岛慧康医院检验科，山东青岛 266520)

·临床检验技术研究·

焦磷酸测序快速检测3种海洋性弧菌的方法学建立及创伤弧菌16S rRNA基因分型的研究

张丽娜1，郑妍2，胡成进1，周月霞1，陈英剑1

(1.济南军区总医院实验诊断科，济南 250031；2.青岛慧康医院检验科，山东青岛 266520)

目的 建立一种海洋致病性弧菌的快速诊断方法，为海洋性弧菌感染的临床检测构建新的技术平台。方法 分别针对创伤弧菌vvhA，副溶血弧菌和溶藻弧菌的toxR基因设计扩增引物和测序引物，并PCR扩增特异性DNA片段，制备单链模板，进行焦磷酸测序，得到的碱基序列经NCBI比对验证；对创伤弧菌16S rRNA基因进行分型。结果 创伤弧菌的扩增引物和测序引物均表现出较好的特异性，4株创伤弧菌均扩增出167 bp大小的DNA片段，并且测序结果与NCBI比对达到100%匹配度，而其他菌株未见扩增条带，测序结果为阴性；11株副溶血弧菌和溶藻弧菌均分别扩增出105 bp和134 bp大小的DNA片段，并且经测序得到与预期相符的DNA碱基序列。4株创伤弧菌中1株属于16S rRNA-A型，其余3株均属于16S rRNA-B型。结论 本研究建立的PCR-焦磷酸测序方法是一种短核苷酸序列实时测定的新方法，具有高通量、精确、简单易行的优点，适用于海洋性致病菌及陆地感染细菌的快速精准鉴定。

海洋性弧菌；焦磷酸测序；快速诊断；聚合酶链式反应

近年来海洋致病性弧菌已成为危害人类健康的重要病原菌之一，其感染进展迅速，可引起胃肠炎、菌血症等，死亡率较高[1-2]。而一般的微生物检测方法耗时长，操作繁琐，并且需要实验人员具备一定的经验[3]。所以，亟须建立一种快速诊断海洋性弧菌的方法。本研究利用PCR-焦磷酸测序技术建立海洋性致病弧菌的检测方法，旨在用于大中型实验室的海洋微生物快速精确鉴定，为临床海洋性弧菌感染的早期快速诊断提供科学的适宜技术，并对海洋创伤弧菌进行16S rRNA基因分型。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究中所用的菌株均已明确鉴定，其中海洋创伤弧菌(M06)为韩国首尔大学食品生物技术与毒理营养研究所Sang Ho Choi惠赠，标准菌株创伤弧菌ATCC 27562、溶藻弧菌ATCC 17749等其余弧菌属细菌来自于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(青岛)(表1所示)，其他非弧菌属细菌均来源于济南军区总医院临床分离保存菌株。

表1 菌株来源信息

1.2 仪器与试剂 PyroMark ID检测系统(瑞典Biotage公司)，低温高速离心机Centrifuge 5430R(德国Eppendorf公司)，荧光凝胶成像分析系统(美国UVP公司)，TC-XR型基因扩增仪(日本BIOER公司)；2×PCR PreMix、DNA marker 2000(大连宝生物公司)，GoldView I型核酸染料(北京索莱宝公司)，2216E琼脂粉(青岛日水公司)，Streptavidin Sepharose(GE Healthcare公司)，焦磷酸测序试剂盒(Qiagen公司)。

1.3 方法

1.3.1 细菌培养及DNA模板的制备 取弧菌属细菌采用三区划线法接种于海洋微生物培养基2216E平板，培养温度为28 ℃。非弧菌属细菌接种于血平板，培养温度为37 ℃， 置于培养箱中培养过夜。

采用煮沸法提取细菌DNA：取50 μL ddH2O于1.5 mL EP管中，挑取菌落调至1～2个麦氏浊度单位，振荡15 s，煮沸10 min后立即冰浴3 min，13 000 r/min离心5 min，取上清作为DNA模板，-20 ℃保存备用。革兰阳性菌则需要加入溶菌酶和蛋白酶K破壁后煮沸提取。

1.3.2 引物的设计与合成 根据GenBank数据库中海洋创伤弧菌vvhA和16S rRNA基因序列、副溶血性弧菌toxR基因序列、溶藻弧菌toxR基因序列的同源性比对结果，用Primer Premier 5.0软件设计焦磷酸测序PCR扩增引物和测序引物，引物序列见表2。16S rRNA基因引物设计区域见图1，4个不同的单核苷酸位点的位置分别是第998、1 000、1 013和1 016位。引物均由Invitrogen公司合成。

表2 引物序列信息

注：F，上游引物；R，下游引物；S，测序引物；BIO，生物素标记引物。

注：红色字体处为4个单核苷酸位点。

图1 创伤弧菌16S rRNA基因分型引物设计区域

1.3.3 PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳 PCR反应体系50 μL：2×PreMix 25 μL，10 μmol/L的上、下游扩增引物各1 μL，模板DNA 1 μL和去离子水22 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，退火30 s(其中创伤弧菌vvhA基因和16S rRNA基因扩增退火温度55 ℃，副溶血弧菌toxR基因扩增退火温度58 ℃，溶藻弧菌toxR基因扩增退火温度55 ℃)，72 ℃延伸30 s，30个循环;72 ℃终延伸8 min。6 μL扩增产物与1 μL 6×加样缓冲液混匀，点样于含GoldView I型核酸染料的15 g/L的琼脂糖凝胶中，100 V电泳25 min。荧光凝胶成像分析系统下观察结果。

1.3.4 焦磷酸测序 取20 μL PCR扩增产物加样于八联排PCR管中，加入2 μL链霉亲合素包被的磁珠、40 μL结合缓冲液(binding buffer)和18 μL超纯水，室温1 400 r/min摇动10 min；打开真空泵开关，将真空工具(vacuum prep tool)在高纯水中清洗30 s，然后抓取PCR管中与磁珠结合后的PCR产物，分别在70%乙醇中清洗5 s，变性缓冲液(denatureation buffer)清洗5 s，最后移到清洗缓冲液(washing buffer)中清洗10 s；将vaccum prep tool放入含有退火预混液(24.5 μL退火缓冲液和0.5 μL测序引物)的PyroMarkQ24反应板的上方，关掉泵，轻轻摇动，释放磁珠；将PyroMarkQ24反应板在80 ℃放置2 min，自然冷却到室温后放入焦磷酸测序仪。测序程序采用SQA模式，按 ATCG的碱基排列顺序循环10次(基因分型的测定程序采用AQ模式，其余步骤相同)，根据软件给出的剂量在试剂仓中加入底物混合物、酶混合物和4种脱氧核糖核苷酸，将PyroMarkQ24反应板和试剂仓放入PyroMark lD系统中进行焦磷酸测序。测序峰及相应的DNA 碱基序列由软件自动分析产生。

2 结果

2.1 创伤弧菌vvhA基因、副溶血弧菌以及溶藻弧

菌toxR基因PCR扩增结果 创伤弧菌vvhA基因扩增结果显示，4株创伤弧菌均扩增出167 bp大小的DNA片段，而其他弧菌和临床分离株未见扩增条带(图2)；11株副溶血弧菌均扩增出105 bp大小的DNA片段(图3)，11株溶藻弧菌均扩增出134 bp大小的DNA片段(图4)。

注：M，2 000 bp DNA marker；1，阴性对照；2～5，创伤弧菌；6～7，溶藻弧菌；8～9，副溶血弧菌；10～11，哈维氏弧菌；12，美人鱼弧菌；13，查格斯氏弧菌；14，弗氏弧菌；15，费氏弧菌；16，大肠埃希菌；17，肺炎克雷伯菌；18，阴沟杆菌；19，铜绿假单胞菌；20，鲍曼不动杆菌；21，嗜麦芽假单胞菌；22，金黄色葡萄球菌；23，表皮葡萄球菌；24，肠球菌。

图2 创伤弧菌vvhA基因扩增及特异性分析

注：M，2 000 bp DNA marker；1，阴性对照；2～12，副溶血性弧菌。

图3 副溶血弧菌toxR基因扩增

注：M，500 bp DNA marker；1～11，溶藻弧菌；12，阴性对照。

图4 溶藻弧菌toxR基因扩增

2.2 创伤弧菌vvhA基因、副溶血弧菌以及溶藻弧菌toxR基因焦磷酸测序结果 所有菌株的焦磷酸测序均测出22～30 bp大小不等的DNA碱基序列，从表2可观察到，创伤弧菌MO6测出的碱基序列与NCBI网站比对的MO6的vvhA碱基序列完全一致(GenBank: KU680790.1)，其中第5个碱基为G，第26个碱基为A；而另外3株创伤弧菌的第26个碱基均突变为C，其中创伤弧菌C6的第5个碱基突变为C。11株副溶血弧菌测出的碱基序列均为5′-TGTAAACAGCAGTACGCAAATCGG-3′，11株溶藻弧菌测得的碱基序列均为5′-GAGTTGGTAGCCACGTTTAGGT-3′，并且与NCBI网站比对的匹配率均达到100%。

表3 创伤弧菌焦磷酸测序检测结果

2.3 创伤弧菌16S rRNA基因PCR扩增和焦磷酸测序结果分析 4株创伤弧菌均扩增出121 bp大小的16S rRNA的DNA片段，并经过焦磷酸测序结果发现，其中创伤弧菌MO6 4个单核苷酸位点测出的碱基分别为TAAA，属于16S rRNA-B型，其余3株测出的碱基分别是为ATGC，均属于16S rRNA-A型。见图5。

注：M，500 bp DNA marker；1，阴性对照；2～5，创伤弧菌。

图5 创伤弧菌16S rRNA基因扩增

3 讨论

微生物的检测已从传统的生化免疫学方法逐渐转向基因水平[4]。特定序列的确定是细菌鉴定与分类的黄金标准，常用的sanger法适合长序列的测定，操作复杂，在临床实验室中应用受限[5]。本研究中建立的PCR-焦磷酸测序方法是短核苷酸序列实时测定的一种新方法[6]，既可用于已知序列的验证性测序，又可用于未知序列的探索性测序，结果分析也非常简单，无需复杂的分析软件，具有高通量、自动化、简单易行的优点，适用于微生物快速精确鉴定。

细菌16S rRNA基因被认为是细菌种属水平检测的专属基因。但是，海洋性弧菌属细菌的16S rRNA序列高度保守，比如，创伤弧菌的核酸序列和纳瓦拉弧菌的一致性高达96%，与33株其他弧菌的核酸相似性也达到90%以上[7]。此外，焦磷酸测序只能测出几十个核苷酸序列，因此，不适于用16S rRNA作为高同源性海洋性弧菌检测的靶标基因。水溶性胞外蛋白溶细胞素为创伤弧菌一个重要的致病因子，vvhA是其编码基因[8]。因此，我们使用vvhA基因作为创伤弧菌检测的靶基因。研究发现，副溶血弧菌和溶藻弧菌的同源性非常高，tlh基因、tdh基因的引物均不能用于两者的鉴别[9]。Croci等[10]评估了不同靶基因的副溶血弧菌的PCR的鉴定方法，指出toxR基因作为靶基因具有理想的准确性，本研究结果也支持这一观点。

本研究通过PCR-焦磷酸测序技术建立了海洋性创伤弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌快速鉴定的方法，仅通过二十几个碱基序列就可鉴定特异性弧菌，而其他对照菌株未扩增出目的条带。针对创伤弧菌vvhA基因的焦磷酸测序结果，我们查找其编码的蛋白质氨基酸序列发现，共450个氨基酸组成中测出的突变位点是第119个氨基酸丝氨酸和第126个氨基酸丙氨酸位点，分别发生G-C和A-C突变后，密码子UCU和GCC变成UCG和GCG，表明该位点虽然发生了突变但其氨基酸序列没有改变, 以致该基因表达的溶细胞素蛋白没有发生变化。

根据16S rRNA基因的序列变异，海洋创伤弧菌又进一步分为2个基因型，分别是16S rRNA基因A型和B型。Vickery等[11]发现，94%的致死临床株属于16S rRNA-B型，而环境株中仅占6%，这表明16S rRNA基因型可能是创伤弧菌潜在毒力的一种指标。基因分型对流行病学监测有重要意义，有助于从基因水平了解细菌的致病机制和耐药机制，为临床患者的个体化用药提供依据。据文献报道，创伤弧菌16S rRNA两种基因型的1 536个碱基中有17个碱基不同[12]，故选取5′末端的4个核苷酸位点设计焦磷酸测序基因分型试验，并成功对4株创伤弧菌进行了基因分型。但是，由于实验菌株数量有限，对此有待于进一步扩大菌株数进行验证。

本研究建立的PCR-焦磷酸测序方法是短核苷酸序列实时检测的一种新方法，具有高通量、高效精确、自动化、简单易行的优点，不仅适用于海洋性致病菌的快速鉴定，也适用于陆地感染细菌的快速精确鉴定。

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(本文编辑：刘群)

Establishment of a PCR-pyrosequencing method for the rapid detection of three marine vibrios and the investigation on 16S rRNA genotyping ofVibriovulnificus

ZHANGLi-na1,ZHENGYan2,HUCheng-jin1,ZHOUYue-xia1,CHENYing-jian1

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,GeneralHospitalofJinanMilitaryRegionofPLA,Jinan250031,Shandong; 2.DepartmentofLaboratoryMedicine,HuiKangHospitalofQingdao,Qingdao266520,Shandong,China)

Objective To establish a rapid diagnostic method for the detection of marine vibrios, and then construct a new technology platform for the clinical diagnosis of marine vibrio infection. Methods A pair of PCR primers and a sequencing primer based on thevvhAgene ofV.vulnificusand thetoxRgenes ofV.parahemolyticusandV.alginolyticuswere designed respectively, and then the specific DNA fragments were amplified. Next, the single-stranded DNA templates were prepared for pyrosequencing. The obtained base sequence was validated by NCBI alignment. In addition, the 16S rRNA genotyping ofV.vulnificuswas also performed. Results The PCR primers and sequencing primer ofV.vulnificusshowed good specificity, and a 167 bp DNA fragment was amplified from 4 strains ofV.vulnificus. The pyrosequencing results completely matched with thevvhAgene sequence ofV.vulnificus. Meanwhile, the control strains were negative. A 105 bp DNA fragment and a 134 bp DNA fragment were amplified from 11 strains ofV.parahemolyticusandV.alginolyticus, respectively, and the pyrosequencing results were consistent with the expected sequence. In addition, one of 4 strains ofV.vulnificuswas identified as 16S rRNA-A type, and the other 3 as 16S rRNA-B type. Conclusion The PCR-pyrosequencing method established in this study is a new method for the real-time detection of short nucleotide sequences. It has some advantages such as high throughput, high precision and simple operation, and may be applied to the fast and accurate identification of marine and terrestrial pathogenic bacteria.

marine vibrio; pyrosequencing; rapid diagnosis; PCR

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.01

全军“十二五”科研重点项目(BWS12J014)。

张丽娜，1987年生，女，技师，硕士，研究方向为分子生物学。

胡成进，主任医师，博士，E-mail:hcj6289@163.com。

R446.5

A

2017-05-19)