维持性血透治疗的2型糖尿病肾病患者血浆eotaxin-2、sTNFRⅡ等表达水平与代谢综合征状态的关系

路萍，许化溪，苏兆亮

(1.江苏大学医学院免疫学与免疫检验学系, 江苏镇江 212013；2.江苏大学附属人民医院肾内科，江苏镇江 212001)

·临床实验研究·

维持性血透治疗的2型糖尿病肾病患者血浆eotaxin-2、sTNFRⅡ等表达水平与代谢综合征状态的关系

路萍1,2，许化溪1，苏兆亮1

(1.江苏大学医学院免疫学与免疫检验学系, 江苏镇江 212013；2.江苏大学附属人民医院肾内科，江苏镇江 212001)

目的 探讨维持性血透(MHD)治疗的2型糖尿病肾病(DN)患者血浆嗜酸性粒细胞趋化因子-2(eotaxin-2)、可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ、Ⅱ(sTNFRⅠ、Ⅱ)等表达水平与代谢综合征(MS)状态的关系。方法 选取接受MHD治疗3个月以上且病情稳定的DN患者30例，以首次确诊且尚未实施任何治疗的单纯2型糖尿病(T2D)患者和体检健康者各30例为对照；检测MS相关指标血压、腰围、体质指数、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、C反应蛋白(CRP)等；AAH-INF-G3抗体芯片法分析40种细胞因子的表达水平；Pearson法分析其与MS相关指标的相关性。结果 DN患者和T2D患者MS发生率分别为88.89%和33.33%。与T2D患者和健康人对照者相比，DN患者有较多的MS危险因素个数、较高的腰围和较低的体质指数；血浆eotaxin-2和趋化因子I-309水平升高，同时伴有sTNFRⅠ、Ⅱ的表达水平升高。Pearson相关分析提示，血浆eotaxin-2、I-309与MS危险因素TG、FBG及舒张压(DBP)水平等呈现明显正相关。此外，血浆sTNFRⅡ和I-309表达水平均与CRP水平呈显著正相关。结论 MHD治疗的DN患者机体内存在着消耗性MS微炎症状态。糖脂代谢的异常影响机体的免疫生理状态，造成免疫炎症微环境。eotaxin-2、I-309可能参与这种微炎症状态的慢性化、持续化，并进一步通过sTNFRⅠ、Ⅱ的上调而加重肾脏损伤，导致MHD治疗的DN患者MS状态的形成。

糖尿病肾病；代谢综合征；嗜酸性粒细胞趋化因子-2；可溶性肿瘤坏死因子受体

糖尿病肾病是导致终末期肾脏病预后最差的基础疾病。代谢综合征(metabolic syndrome，MS)是以腹型肥胖、糖耐量异常、胰岛素抵抗、血脂异常及高血压为特征的一组临床综合征[1]，在糖尿病肾病患者体内普遍存在着MS的多个危险因素组分[2-3]。本研究以维持性血透(maintenance hemodialysis, MHD)治疗的2型糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)为研究对象，分析其糖脂代谢异常与发生MS的炎症微环境的关系，为进一步了解此类疾病及其并发症的发生机制积累数据,为预防和早期干预以及有效减少并发症寻找理论依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象 选取2013年11月至2015年1月在江苏大学附属人民医院人工肾规律血液透析治疗超过3个月的稳定的DN患者30例(DN组)，男25例，女5例，年龄(54.20±6.63)岁；初诊尚未进行治疗的单纯2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)患者30例(T2D组)，男22岁，女8岁，年龄(53.87±12.20)岁；同期门诊体检健康者30例(N组)，男23例，女7例，年龄(51.17±6.42)岁。所有受试者均排除风湿、结缔组织疾病、多囊肾、泌尿系梗阻、肿瘤及其他慢性消耗性疾病。患者清晨空腹采血，血浆样本冻存备用。本研究经医院伦理委员会审议通过，所有受试对象自愿参加并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 MS相关指标检测 所有调查对象清晨空腹测定身高、体重，先静坐放松10 min，然后用汞柱式血压计测定血压3次，每次间隔1 min，以Korotkoff第1音为收缩压(SBP)，第5音为舒张压(DBP,缺乏此音时按第4音记录)，取3次测量水平的平均值作为其血压值。腰围(WC)在清晨空腹、立位、自然呼吸状态下测定，取肋弓下缘与髂嵴之连线中点，皮尺测量水平周径2次的平均值。体质指数(body mass index, BMI)计算公式：BMI=体重(kg)/身高(m)2。生化指标测定用AU5800全自动生化仪(美国Beckman公司)进行。以酶比色法测定三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)，试剂由上海荣盛公司提供；直接法测定高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，试剂由绍兴美迪康公司提供；己糖激酶法测定空腹血糖(FBG)，试剂由北京万泰德瑞公司提供。用Astep全自动特定蛋白分析仪及配套试剂盒(深圳国赛公司)以散射比浊法测定C反应蛋白(CRP)。

1.2.2 MS诊断标准 根据2005年美国国家胆固醇教育计划成人治疗组第3次指南(American Cholesterol Education Program-Adult Treatment PaneⅢ,ATPⅢ)修订标准对MS的定义[4]，符合以下3项及以上者即为MS。(1)中心性肥胖：腰围≥102 cm(华人男性为90 cm)或≥88 cm(华人女性为80 cm)；(2)高水平TG：TG≥1.7 mmol/L或已接受药物治疗；(3)低水平HDL-C：HDL-C<1.03 mmol/L(男)或<1.3 mmol/L(女)，或已接受药物治疗；(4)血压异常：SBP≥130 mmHg或DBP≥85 mmHg,或已接受药物治疗；(5)FBG异常：FBG≥5.6 mmol/L或已接受药物治疗。并按照上述标准对受试对象的5个MS危险因素的个数进行计数。

1.2.3 抗体芯片法检测各种炎症因子 用人类细胞因子AAH-INF-G3抗体芯片(美国RayBiotech公司)分析40种血浆炎症因子，按说明书操作，灵敏度达到pg/mL等级。应用InnoScan 300 Microarray Scanner激光扫描仪(法国Innopsys公司)扫描(扫描参数：波长532 nm；分辨率10 μm)，并经芯片分析软件获得荧光信号强度。检测中，各项质控指标均符合标准。芯片上各种细胞因子抗体的点阵分布见图1A，阳性对照点(POS)均能清晰显示，阴性对照点(NEG)均未有信号检出，所测荧光信号值需去除背景信号值后进行标化。

2 结果

2.1 ATPⅢ诊断标准下3组受试对象MS的发生率及MS相关指标比较 MHD治疗的DN患者和单纯T2D患者MS发生率分别为88.89%和33.33%。与健康人对照组相比，MHD治疗的DN组患者有较高的WC、CRP、FBG、SBP、DBP及MS危险因素个数，较低的BMI、HDL-C水平，差异有统计学意义；与T2D组相比，MHD治疗的DN组的CRP、SBP水平升高并具较高的MS危险因素个数，而BMI、血糖和TG水平则降低，差异有统计学意义。见表1。

2.2 DN患者细胞因子检测结果 与健康人对照和T2D组相比，MHD治疗的DN患者血浆可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ、Ⅱ(sTNFRⅠ、sTNFRⅡ)、嗜酸性粒细胞趋化因子-2(eotaxin-2/CCL24)和重组人趋化因子I-309(I-309/CCL1)的荧光信号强度明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；干扰素诱导蛋白10(IP-10)荧光信号强度较健康人对照组高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。

2.3 DN患者eotaxin-2、 sTNFRⅡ等炎症因子荧光信号强度与MS相关指标的相关性分析 MHD治疗的DN患者血浆eotaxin-2水平与TG、FBG、TC、LDL-C水平呈明显正相关(r=0.760、0.539、0.557、0.442，P均<0.05)；I-309与DBP、LDL-C水平呈现明显正相关(r=0.362、0.431，P均<0.05)；此外，sTNFRⅡ和I-309表达水平均与CRP水平呈显著正相关(r=0.437、0.696，P均<0.05)，两者之间也呈明显的正相关(r=0.687,P<0.01)。

注：A，AAH-INF-G3抗体芯片检测的40种目标因子排布,POS为阳性对照点,NEG为阴性对照点；B，AAH-INF-G3抗体芯片检测结果。

图1 3组受试对象有意义细胞因子荧光信号强度比较

注：与健康人对照组比较，**P<0.01；与单纯2型糖尿病组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

表2 3组受试对象有意义炎症因子荧光信号强度比较

注：与健康人对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与单纯2型糖尿病组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

3 讨论

影响MHD治疗的DN患者长期生活质量及预后的主要因素为患者的基础身体状态及其并发症状况。如何及时、有效、有针对性地改善患者的基础状态并对并发症进行处理，临床意义重大。近年来，在糖尿病、代谢综合征、慢性肾脏病等慢性进展性疾病中均发现慢性微炎症状态[5-6]。接受MHD治疗的DN患者同时具有上述各类疾病的表现，其临床治疗更具复杂性。本研究表明，MHD治疗的2型DN患者与初诊单纯T2D患者和健康人对照者相比，出现明显的消耗性代谢综合征状态，主要表现为较多的MS危险因素个数、高WC和低BMI。

T2D是一类糖脂代谢异常性疾病，免疫代谢的概念给进一步了解和阐明T2D的发生发展提供了新的思路[7]。蛋白质抗体芯片技术是一种高通量的蛋白功能分析技术，能短时、高效、同步完成多种因子的检测，其强大的信息量使研究者更全面了解各因子之间的复杂网络关系。鉴于此，本研究用AAH-INF-G3抗体芯片技术对MHD治疗的DN和T2D患者血浆40种细胞因子进行分析，发现血浆eotaxin-2和I-309水平升高，同时伴有sTNFRⅠ、Ⅱ的表达水平升高，IP-10在DN组表达水平升高，相关性分析表明，MHD治疗的DN患者血浆eotaxin-2和I-309水平分别与MS相关指标TG、FBG、DBP等水平呈现明显正相关。此外，血浆sTNFRⅡ和I-309水平均与反映病原微生物急性感染的标志物CRP水平呈显著正相关。近年研究表明，慢性肾功能不全患者血清TNF-α及其受体sTNFRⅠ、Ⅱ表达水平显著升高，并参与其免疫损伤的病理过程[8-9]，趋化因子IP-10则趋化TH1淋巴细胞的分化，导致临床微炎症状态的形成，这与本研究发现的MHD治疗的DN患者sTNFRⅠ、Ⅱ、IP-10水平升高相一致。

Libetta等[10]研究发现终末期肾脏病患者存在细胞因子网络失衡，表现为TH2型细胞优势，eotaxin-2、I-309是TH2型细胞因子的2种趋化因子的配体，可通过募集及趋化TH2型淋巴细胞到达气道炎症区域，参与支气管哮喘、变应性鼻炎、鼻息肉等多种过敏及慢性炎症性疾病的发生、发展。由此推测，MHD治疗的DN患者可因糖脂代谢的异常影响机体的免疫生理状态，形成免疫损伤造成免疫炎症微环境，eotaxin2、I-309参与了这种微炎症状态的慢性化、持续化，并进一步通过sTNFRⅠ、Ⅱ的上调而加重肾脏损伤,导致维持性血透治疗2型糖尿病肾病患者代谢综合征状态形成。

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(本文编辑：刘群)

Correlations of plasma eotaxin-2, sTNFR Ⅱ and other cytokines levels with the status of metabolic syndrome in type 2 diabetic nephropathy patients treated with maintenance hemodialysis

LUPing1,2,XUHua-xi1,SUZhao-liang1

(1.DepartmentofImmunology,SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu; 2.DepartmentofNephrology,theAffiliatedPeople′sHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,Jiangsu,China)

Objective To investigate the correlations of plasma eotaxin-2, soluble tumor necrosis factor receptor(sTNFR) Ⅱ and other cytokines levels with the status of metabolic syndrome(MS) in type 2 diabetic nephropathy(DN) patients treated with maintenance hemodialysis(MHD). Methods Thirty type 2 DN patients with stable pathogenetic conditions and MHD treatment for more than 3 months, thirty newly diagnosed and untreated type 2 diabetes(T2D) patients and thirty healthy volunteers were enrolled in the study. The MS related markers, including blood pressure, waist circumference, body mass index, triglyceride(TG), high density lipoprotein cholesterol(HDL-C), fasting blood glucose(FBG), total cholesterol(TC), low density lipoprotein cholesterol(LDL-C) and C reactive protein(CRP), were determined. The expression levels of 40 cytokines were detected with the AAH-INF-G3 antibody microarray, and their correlations with MS related markers were analyzed by the Pearson method. Results The incidence rates of MS in DN patients with MHD and T2D patients were 88.89% and 33.33%, respectively. Compared with T2D patients and healthy controls, the DN patients had more MS related markers, higher waist circumference and lower body mass index, and their plasma eotaxin-2, I-309 and sTNFRⅠ/Ⅱ levels increased significantly. Pearson correlation analysis showed that plasma eotaxin-2 and I-309 levels were positively related to MS risk factors such as TG, FBG and diastolic blood pressure(DBP) levels. Plasma sTNFR Ⅱ and I-309 levels were significantly positively correlated with plasma CRP levels. Conclusion A micro inflammatory state exists in type 2 DN patients with MHD. Abnormal glycolipid metabolism may influence on the immunologic and physiological state of human body, and then form the micro inflammatory state. Eotaxin-2 and I-309 may participate in this chronic and persistent process and further induce renal damage by upregulating sTNFR Ⅰ/Ⅱ levels, which may result in the formation of MS state in type 2 DN patients with MHD.

diabetic nephropathy; metabolic syndrome; eotaxin-2; soluble tumor necrosis factor receptor

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.07

镇江市2014年度社会发展科技支撑项目(SH2014051)；江苏省检验医学重点实验室开放基金项目(JSKLM-2014-012)；江苏省重点研发计划项目(BE2016716)。

路萍，1980年生，女，博士研究生，副主任医师，从事血液净化基础与临床工作，E-mail：lp8012@163.com。

R692.5

A

2017-03-13)