浒苔多糖体外抗犬冠状病毒临床分离株的作用研究

孙秋艳，沈美艳，朱明恩，李 舫

(山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061)



浒苔多糖体外抗犬冠状病毒临床分离株的作用研究

孙秋艳，沈美艳，朱明恩，李 舫*

(山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061)

利用A72细胞(犬纤维肉瘤细胞系)从山东某宠物医院临床上表现为急性胃肠炎症状的幼犬腹泻粪便中分离到1株病毒，通过间接免疫荧光(IFA)和RT-PCR进行鉴定,确定为犬冠状病毒，命名为CCoV-SW1。为探讨浒苔多糖(EPS)体外抗CCoV-SW1毒株的作用效果，以A72细胞为细胞模型，通过直接杀灭、抑制复制及阻断吸附3个方面进行研究。结果表明，EPS对A72细胞最大安全浓度为62.5 mg/L；EPS对CCoV感染A72细胞抑制率与EPS质量浓度有一定量效关系；EPS对CCoV具有直接杀灭和阻断吸附的作用，并且与EPS浓度具有量效关系；EPS抑制CCoV复制效果不明显，但仍有一定效果，当EPS浓度为62.5 mg/L时，细胞存活率为37.2%。EPS在体外对CCoV具有直接杀灭和阻断吸附的作用，为CCoV的预防和治疗提供依据。

浒苔多糖；犬冠状病毒山东分离株；分离鉴定；抗病毒作用

犬冠状病毒 (Canine coronavirus，CCoV)是引起犬冠状病毒病的主要病原，自1985年徐汉坤等[1]首次报道CCoV在我国的流行以来，不断出现有关CCoV感染的报道[2-4]。CCoV主要引起犬的急性胃肠炎症状，发病率和病死率较高，是当前对我国养犬业危害较大的病原。CCoV具有高度传染性，其病原的分离鉴定和早期诊断对该病的预防控制具有重要的意义。浒苔(Enteromorpha)是绿藻植物石莼科中的水生藻类植物。浒苔多糖(Enteromorphapolysaccharide，EPS)是浒苔的关键活性成分，EPS具有抗肿瘤、降血脂、降血糖、抗氧化、抗病毒及免疫调节等功能[5-9]，目前尚未见有关EPS抗CCoV研究的报道。本试验首先从上海某宠物医院临床上表现为急性胃肠炎症状的3月龄幼犬腹泻粪便中，通过细胞分离培养，成功分离到1株病毒，通过间接免疫荧光和RT-PCR进行鉴定，确诊分离病毒株为CCoV；通过EPS对CCoV体外作用的研究，旨在发现预防及治疗CCoV药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及毒株 参考毒株CCoV 1-71株，A72(犬纤维肉瘤细胞系，Canine fibrosarcoma cell)细胞由山东畜牧兽医职业学院动物检测中心保存；细胞生长液含100 mL/L胎牛血清的DMEM，病毒增殖的维持液含50 mL/L胎牛血清的DMEM。

1.1.2 主要试剂 羊抗鼠IgG-TRITC，Jackson ImmunoResearch公司产品；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；病毒RNA提取试剂盒，天根生化有限公司产品；AMV第1链cDNA合成试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；MTT、DMSO，美国Sigma公司产品。

1.1.3 浒苔多糖 浒苔分离纯化后浒苔多糖含量为69.2%，多糖组成成分和含量见表1，为山东畜牧兽医职业学院检测中心研发，使用时按试验要求进行稀释。

表1 EPS组成成分及含量

1.1.4 病料 来自于山东某宠物医院3月龄幼犬腹泻粪便，临床症状为精神不振，呈嗜睡状，食欲减少或废绝，无体温变化；口渴，鼻镜干燥，呕吐，持续6 d出现腹泻；粪便呈粥样，暗褐色，恶臭，混有黏液或少量血液。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分离培养 将采集的粪便样品用含150 mL/L胎牛血清的DMEM培养液1∶5稀释，8 000 r/min离心30 min，取上清液，用0.22 μm的微孔滤膜滤器过滤，收集滤液接种于长满单层的A72细胞，连续观察7 d，不出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)的连续传7代，如仍不出现CPE则视为阴性；有CPE继续传代，直到CPE稳定，然后鉴定。

1.2.2 间接免疫荧光鉴定

1.2.2.1 鼠抗CCoV高免血清的制备 将参考毒株CCoV 1-71和CCoV 分离株大量培养，制备病毒抗原置-80℃冻存。将制备的抗原用弗氏完全佐剂乳化，分别免疫6周龄Balb/c小鼠；第2周用弗氏不完全佐剂乳化；再隔3 d加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化。每周采血，测定血清中和抗体琼扩效价达1∶8以上时，心脏采血，分离血清，测定中和抗体效价，该血清用作下列试验的一抗，置-20℃备用。

1.2.2.2 间接免疫荧光鉴定试验方法 按常规方法进行[10]。

1.2.3 RT-PCR的鉴定

1.2.3.1 引物合成 参照GenBank编号为AY796289.1的CCoV S基因的核苷酸序列，设计1对特异性引物，Primer(Forward)：5′-GCAACTAGTTCTGATTTTGTTC-3′；Primer(Reverse)：5′-GCGTTAATTAACCTGCAGGGGCTGTGA-3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3.2 RNA的提取 处理粪便上清液、第7代细胞培养物、第9代细胞培养物、第12代细胞培养物及将参考株CCoV 1-71，按照病毒RNA提取试剂盒说明书进行操作，提取RNA，参考株CCoV 1-71作为阳性对照。

1.2.3.3 cDNA的生成 按照AMV第1链cDNA合成试剂盒说明书进行操作，合成cDNA。

1.2.3.4 PCR反应 反应体系条件参考文献[10]进行。

1.2.4 CCoV TCID50的测定 按Reed-Muench法测定病毒的TCID50。

1.2.5 EPS对A72细胞安全浓度测定 称取高压灭菌EPS用细胞维持液稀释成1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.7、7.9 mg/L的浓度，加到长成单层A72的96孔细胞培养板上，0.1 mL/孔，每个浓度重复4孔，另设细胞对照，37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养，每隔12 h观察CPE情况，72 h 后，弃上清，每孔加5 mg/L的MTT溶液20 μL，37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中继续培养4 h后，轻轻将上清液弃去，每孔加DMSO溶液120 μL，充分振荡混匀10 min，用酶标仪检测490 nm处光密度值，进行细胞存活率(CSR)的计算。CSR=(试验组平均光密度值-对照组平均光密度值)/对照组平均光密度值×100%。

1.2.6 EPS对CCoV感染A72细胞抑制作用的试验 在EPS对A72细胞最大安全浓度范围内，2倍倍比稀释EPS，选取8个稀释度的稀释液分别与等体积100 TCID50CCoV混合,加到长成单层ST的96孔细胞培养板上，0.1 mL/孔，每个稀释度重复4孔，另设细胞对照和病毒对照，37℃、体积分数为5% CO2温箱中培养，同1.2.5操作测定CSR，计算EPS对CCoV感染A72细胞抑制率，抑制率=(试验组平均光密度值-病毒组平均光密度值)/(细胞对照组平均光密度值-病毒组平均光密度值)×100%。

1.2.7 EPS体外抗CCoV感染A72细胞试验 试验设EPS组、细胞对照组及病毒对照组，以A72细胞安全浓度最高质量浓度，用细胞维持液对EPS作2倍连续倍比稀释，选取8个稀释度，每个稀释度做4个重复，分别进行以下试验。

1.2.7.1 对CCoV直接杀灭作用 EPS每个稀释度的稀释液分别与等体积1 000 TCID50病毒液混合,37℃、体积分数为5% CO2培养箱中作用2 h，加到长成单层A72的96孔细胞培养板上，0.1 mL/孔，37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养4 h，弃去上清液，加入细胞维持液，0.1 mL/孔，37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养72 h，测定CSR。

1.2.7.2 抑制CCoV复制作用 先将1 000 TCID50病毒液接种至长成单层A72的96孔细胞培养板上，0.1 mL/孔，37℃、5% CO2培养箱中培养吸附2 h，弃去病毒液，PBS洗单层细胞2次，加入EPS稀释液，0.1 mL/孔，37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养72 h，测定CSR。

1.2.7.3 阻断CCoV吸附作用 EPS每个稀释度的稀释液加到长成单层A72的96孔细胞培养板上，0.1 mL/孔，37℃、体积分数为5% CO2培养箱中作用48 h，弃去EPS稀释液,PBS洗单层细胞2次，每孔加入1 000 TCID50病毒液0.1 mL，37℃、5% CO2培养箱中作用2 h，弃去病毒液，PBS洗单层细胞2次，加入维持液，0.1 mL/孔，37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养72 h，测定CSR。

1.2.8 数据统计分析 利用SPSS Statistics 19.0统计分析软件进行数据处理25，多重比较用LSD法进行，试验数据用平均值+标准差表示，并进行统计学分析。

2 结果

2.1 CCoV的分离培养

将处理好的病毒液接种A72细胞，在第6代盲传时，A72细胞于24 h出现轻微病变,表现为个别细胞变圆、融合；盲传至第7代18 h后可观察到明显的CPE，表现为细胞圆缩,聚集成团，少数细胞脱落；在48 h后,95%单层细胞脱落，对照细胞正常。传至第9代细胞病变稳定，产生病变时间为18 h。

2.2 IFA鉴定

2.2.1 鼠抗CCoV高免血清的制备 采免疫鼠血液，制备血清，中和试验测定血清效价，鼠抗CCoV 1-71株中和抗体效价为1∶2 048，鼠抗CCoV-SW1中和效价为1∶512。

2.2.2 IFA试验 用TRITC标记的羊抗鼠IgG抗体，采用IFA加DAPI方法对分离毒株进行鉴定。结果表明，接毒细胞18 h可观察到特异性细胞浆内荧光(图1)。

1.共聚焦显微镜下TRITC发出的橙红色荧光；2.共聚焦显微镜下DAPI染色后的细胞核；3.共聚焦显微镜下A与B图合并后特异性细胞浆内荧光

1.TRITC orange red fluorescence under confocal microscope；2.API stained cell nuclei under confocal microscope；3.A and B combined specific cytoplasmic fluorescence under confocal microscope

图1 CCoV-SW1株免疫荧光抗体鉴定结果

Fig.1 The identification results of CCoV-SW1 by immunofluorescence antibody

2.3 RT-PCR的鉴定

CCoV-SW1毒株粪便上清液、第7代细胞培养物、第9代细胞培养物及第12代细胞培养物均能扩增出与参考株CCoV 1-71相同的553 bp目的片段(图2)，从而确定该株病毒为CCoV。对照组犬肠道病料扩增结果为阴性。

M.DNA标准 DL 4 500；1.参考株CCoV 1-71；2.粪便上清液；3. 7代细胞培养物；4. 9代细胞培养物；5. 12代细胞培养物

M.DNA Marker DL 4 500；1.Reference CCoV 1-71；2.CCoV sample；3.The 7thCCoV sample；4.The 9thCCoV sample；5.The 12thCCoV sample

图2 RT-PCR鉴定结果

Fig.2 Identification results of CCoV-SW1 by PT-PCR

2.4 病毒TCID50的测定

CCoV-SW1第12代培养物TCID50为10-5.57/0.1 mL。

2.5 EPS对A72细胞安全浓度测定结果

EPS质量浓度>62.5 mg/L时，细胞存活率显著低于正常细胞对照组(P<0.05)，EPS质量浓度小于或等于62.5 mg/L时，细胞存活率与细胞对照组差异不显著(P>0.05)。因此,EPS对A72细胞安全浓度62.5 mg/L(图3)。

与对照组相比，**表示P<0.01,*表示P<0.05Compared with control group,**P<0.01,*P<0.05

2.6 EPS对CCoV感染A72细胞抑制作用

由图4可以看出，EPS对CCoV感染A72细胞抑制率与EPS质量浓度有一定量效关系，当EPS质量浓度达到15.7 mg/L，对CCoV感染A72细胞抑制率达到50.6%，浓度越高抑制作用越明显。

图4 EPS对CCoV感染A72细胞抑制作用

2.7 EPS体外抗CCoV感染A72细胞试验结果

从图5可以看出，EPS对CCoV具有直接杀灭和阻断吸附的作用，并且与EPS浓度具有量效关系，浓度越高，细胞存活率越高。EPS抑制CCoV复制效果不明显，但仍有一定效果，当EPS浓度为62.5 mg/L时，细胞存活率为37.2%，当EPS浓度达到4.0 mg/L时，细胞存活率为0。

图5 EPS体外抗CCoV感染A72细胞的作用

3 讨论

本研究对山东某宠物医院临床上表现为急性胃肠炎症状的疑似感染CCoV的幼犬腹泻粪便，采用最为敏感的传代细胞系A72细胞进行了病毒分离培养，CCoV通过其表面纤突和易感细胞表面的特异性受体结合可侵入易感细胞，由于CCoV纤突较大，在理化因素的作用下极易脱落，所以本试验采用了含150 mL/L胎牛血清的DMEM进行稀释，可以提高分离CCoV的成功率。细胞病变现象是病毒在细胞内增殖及其对细胞产生损害的最明显的表现。由于各种CCoV毒株毒力的差异，当细胞接种病毒的时候，其出现CPE的时间也不尽相同，某些毒株即或是盲传多代也不出现病变。因此本试验尽可能多的盲传多代，而且等到CPE稳定后，才对病毒进行其他鉴定。本试验采用IFA和RT-PCR进行鉴定，间接免疫荧光试验(IFA)用TRITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗，DAPI染色，TCS-SP5激光共聚焦显微镜观察，此方法不但可以对CCoV进行特异性鉴定，还可以进行病毒定位，灵敏度相当高；RT-PCR方法鉴定分离毒株，排除了细小病毒、轮状病毒感染的可能，从而保证分离的病毒为CCoV。

浒苔是渤海沿海常见的海藻，浒苔大量繁殖漂会破坏海洋生态系统，严重威胁沿海渔业发展，造成巨大经济损失。EPS是浒苔主要活性成分，本试验研究EPS体外抗CCoV的作用，研究结果表明，浒苔多糖对CCoV具有直接杀灭作用，而且多糖浓度越高作用时间越长，直接杀灭作用越好。浒苔多糖对进入细胞内病毒抑制作用不明显，原因可能是CCoV进入细胞的速度太快而多糖进入细胞的速度太慢。浒苔多糖对CCoV吸附细胞具有明显的阻断作用，所以浒苔多糖对CCoV在体外具有一定的抑制作用。本研究说明浒苔多糖有抗病毒的能力,为浒苔多糖在临床上对病毒病的预防和治疗提供了理论依据。

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Study on Anti-CCoV Clinical Isolated Strain byEnteromorphaPolysaccharideinVitro

SUN Qiu-yan,SHEN Mei-yan,ZHU Ming-en,LI Fang

(ShanDongVocationalAnimalScienceandVeterinaryCollege,Weifang,Shandong，261061，China)

An CCoV strain was isolated by using A72 cells from the faeces of a pup with acute gastroenteritis in a pet hospital of Shandong.Through the identification by IFA and RT-PCR,the results demonstrated that the iaolated virus is CCoV,named CCoV-SW1.In order to explore the antiviral effects ofEnteromorphapolysaccharide(EPS), the following experiments,including the directly viruscidal assay, virus inhibition replication assay and virus blocking absorbtion assay with A72 cell model were used.The results indicated that the maximum safety concentration of EPS to A72 cells was 62.5 mg/L;the inhibition ratio to CCoV infected A72 cells of EPS had a quatitative relationship with the EPS concentration;the EPS had a strong anti-CCoV abilityinvitroby directly virucidal effect and blocking absorbtion of the virus to cells,it had a quatitative relationship with the EPS concentration;the effects of EPS to inhibit replication of CCoV was not obvious, but still had some effects,when mass concentration of EPS was 62.5 mg/L,the inhibition ratio of cells was 37.2%. This study indicated that the EPS has a strong anti-CCoV abilityinvitroby directly virucidal effect and blocking absorbtion of the virus to cells,it can provide important scientific data for preventing and treating CCoV.

Enteromorphapolysaccharide;Canine coroanvirus Shandong strain; isolation and identification;antiviral activity

2016-11-14

山东省潍坊市科学技术发展计划项目(2015GX054)

孙秋艳(1978-)，女，山东单县人，讲师，硕士，主要从事预防兽医学研究。*通讯作者

S852.659.6;Q539

A

1007-5038(2017)07-0022-05