SPE-LC-MS/MS检测不同水产品组织中四环素类药物残留的方法研究

孙晓杰，李兆新*，董晓,2，邢丽红，祝付兰，翟毓秀

(1.农业部水产品质量安全检测与评价重点实验室,中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071；2.上海海洋大学食品学院, 上海 201306；3.岛津技迩(上海)商贸有限公司，上海 200052)



SPE-LC-MS/MS检测不同水产品组织中四环素类药物残留的方法研究

孙晓杰1，李兆新1*，董晓1,2，邢丽红1，祝付兰3，翟毓秀1

(1.农业部水产品质量安全检测与评价重点实验室,中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071；2.上海海洋大学食品学院, 上海 201306；3.岛津技迩(上海)商贸有限公司，上海 200052)

采用固相萃取(SPE)结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术，建立了不同水产品组织中四环素类药物残留的测定方法。样品通过含EDTA的弱酸性MCI缓冲盐提取，醋酸铅沉淀蛋白，并结合正己烷和固相萃取 (SPE)同时净化技术，以液相色谱-串联质谱多反应监测(MRM)离子模式定性，工作曲线法定量分析。结果表明，被测组分在对应范围内线性关系良好；方法的检出限为1.00 μg/kg，定量限为5.00 μg/kg；以空白鳗、鲤、海参和河豚鱼作为基质进行回收率评价，四环素、土霉素、金霉素和强力霉素等4种四环素类药物在不同加标浓度时的回收率范围为70% ～100%，相对标准偏差皆小于10% (n=6)。将所建立的方法应用于实际养殖鳗中四环素类药物残留的分析，结果表明，该方法灵敏度高、重现性好，适用于不同水产生物样品中四环素类药物残留的同时检测。[中国渔业质量与标准，2017,7(3):44-51]

水产品；四环素类药物；固相萃取；液相色谱-串联质谱

四环素类(tetracyc1ines，TCs)药物作为水产养殖饲料的药物添加剂，同时起到促生长和预防各种疾病的作用，其用量约占抗生素类药物添加剂总量的57%左右。综合分析中国、欧盟、美国和日本等主要水产品生产国家和地区的药物使用情况可知：四环素类抗生素是少数被允许使用的常用药物之一。由于抗生素可诱导机体内产生抗药菌株，造成人体免疫功能下降，2006年欧盟全面禁止抗生素作为饲料添加剂。欧盟、美国和中国等多个国家和地区已相继制定所有肉制品中四环素类抗生素的最大残留限量(MRL)为100 μg/kg[1]，国际食品法典委员会(CAC)和日本肯定列表规定其最大残留限量(MRL)为200 μg/kg。

近年，高效液相色谱(HPLC)结合紫外检测器[2-6]、荧光检测器[7-9]和质谱检测器[10-12]先后被用于水产品中四环素类药物残留的检测。中国现行水产品中四环素类的检测标准方法均为高效液相色谱法[13-15]，但随着现代分析仪器的发展，液相色谱-串联质谱法已日渐完善并普及[10-12]，与高效液相色谱法相比，除了具有更高的灵敏度外，还可弥补液相色谱法定性困难的不足，是目前抗生素多残留检测的主要技术。同时，传统检测方法适用于鲤、对虾等脂类含量较少的水产品种[16]，对于鳗等油脂含量较高、海参等蛋白含量较高的产品，杂质干扰大且严重影响了前处理效率；另外，方法存在回收率不理想的缺陷[15]，金霉素和强力霉素回收率多低于70%。因此，建立准确、高效、易于操作、适用范围广的四环素类药物多残留检测方法十分必要。

本研究选择水产养殖中常用的四环素类药物(四环素、土霉素、金霉素和强力霉素)作为研究对象，采用含EDTA的弱酸性MCI缓冲盐提取，使用醋酸铅沉淀蛋白，并结合正己烷和固相萃取技术同时净化的方法，建立了鲤、鳗、海参和河豚鱼组织中四环素类药物的液相色谱-串联质谱检测方法，同时实现定性和定量分析。与文献[10-12,17]相比，可检测脂含量差异较大的鲤、鳗，以及多糖含量较高的海参等，扩充了可检测水产品的种类；使用普通高效液相色谱即可满足4种四环素类的同时定性定量；通过优化色谱流动相组成、洗脱程序、样品定容溶液，得到较好的色谱峰型；通过优化提取方式和基质净化条件，提高方法的回收率和适用性；同时使用醋酸铅沉淀蛋白方法明显提高了方法检测效率，满足中国不同水产品组织中四环素类药物多残留的分析测定和确证要求。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

TSQ Quantum Access TM 液相色谱-串联质谱仪(Thermo Fisher Scientific公司，美国) 。Talboys型旋涡混合器(上海安谱科学仪器有限公司)，BT224S分析天平(Sartorius公司，法国)，N-EVAPTM112型氮气吹扫仪(Organomation公司，美国)，Milli-Q 型超纯水仪(Millipore公司，美国)。固相萃取装置(Supelco公司，美国)；Oasis HLB小柱(60 mg/3 mL，Waters公司，美国)，Pharma小柱(60 mg/3 mL，岛津技迩商贸有限公司，上海)。

盐酸土霉素(纯度97. 5%)、盐酸金霉素(纯度99. 0%)、盐酸四环素(纯度98. 0%)、盐酸强力霉素(纯度98.7%)，所有标准品均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。乙腈、甲醇(HPLC 级，Merk公司)；甲酸(HPLC级，Fluka公司)；其他试剂皆为分析纯。

标准储备溶液：分别称取适量的土霉素 (oxytetracycline, OTC)、四环素 (tetracycline, TC)、金霉素 (chlortetracycline, CTC) 和强力霉素 (doxycycline, DOC) 标准品，用甲醇定容配制成1.00 mg/mL的标准储备液，避光-18 ℃ 下保存。

混标使用液：准确吸取土霉素、四环素、金霉素和强力霉素标准储备溶液，用甲醇逐级稀释配成所需浓度的混合溶液，避光4 ℃ 冷藏保存。

基质混合标准工作溶液：根据需要吸取适量土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的混标使用液，分别用对应的空白样品提取液稀释成适当浓度的基质混合标准工作溶液，4 ℃保存。

MCI 缓冲溶液：分别取柠檬酸(C6H8O7·H2O) 12.9 g，磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 10.9 g，乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O) 37.2 g，各自加水溶解，混合后用水定容至1 000 mL，用0. 1 mol/L HCl 或0. 1 mol/L NaOH 调节pH 至4.0±0.05。

醋酸铅溶液：取20.0 g醋酸铅加水溶解后，定容至1 000 mL，配制成20.0 g/L的水溶液。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理方法

1)提取

取水产可食肌肉部分均质处理制成试样。取2.00 g 试样于50 mL 离心管中，加入2 mL醋酸铅溶液和8 mL MCI缓冲液，涡旋1 min，冷水浴超声10 min，8 000 r/min的速率4 ℃离心5 min后，取出上清液；下层继续分别加8 mL和6 mL MCI缓冲液，按照上述步骤重复提取两次，合并3次上清液有机提取液，定容至25 mL。

2)净化

向上述提取液中加入正己烷10 mL，涡旋1 min后，8 000 r/min的速率离心5 min，去除上层液，下层溶液待进一步净化。依次用5 mL甲醇和5 mL水活化Oasis HLB柱，取待净化液12.5 mL过柱，然后分别用5 mL水和5 mL 5% 甲醇水溶液淋洗萃取柱，弃去全部流出液，减压抽干5 min。最后用5 mL 甲醇 ∶乙酸乙酯(10 ∶90，V/V) 洗脱，洗脱液用氮气吹干(温度不超过40 ℃) 。准确加入1.0 mL 初始比例的流动相，涡旋溶解残留物，过0.22 μm 微孔滤膜到进样瓶中，供液相色谱-质谱仪测定。

1.2.2 仪器方法

色谱条件：MGⅡC18色谱柱(2.1 mm×150 mm，2.1 μm)；进样量为10 μL；柱温为30 ℃；流速为0.2 mL/ min；流动相A为0.1% 甲酸水溶液；流动相B为乙腈。梯度洗脱程序：0.0～0.5 min，10% B；0.5～3.0 min，10%～90% B；3.0～6.0 min，90% B；6.0～7.0 min，90%～10% B；7.0～8.0 min，10% B。

质谱条件：电喷雾电离源(ESI)，多反应监测(MRM)离子模式；正离子检测(ESI+)，喷雾电压为4 200 V；鞘气和辅助气体均为高纯氮气，鞘气压力为35 L/min，辅助气压力为10 L/min，碰撞气为氦气，诱导解离电压为10 V；离子传输杆温度为350 ℃。碰撞能及其他相关质谱条件见表1。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法优化

2.1.1 提取剂及提取方式优化

四环素类药物较不稳定，在强酸或碱性条件下易分解变性，同时可与溶液中金属离子络合，在生物体中易与蛋白结合，因此需要在提取缓冲液中加入金属络合剂并调节提取液至合适酸性以除去蛋白。本研究以空白水产品为基质，加入含EDTA的弱酸性MCI缓冲盐作为提取液，同时加入醋酸铅作为蛋白沉淀剂，通过高速离心可以将蛋白和四环素类药物分离较彻底，根据需要用0.1 mol/L HCl 或0.1 mol/L NaOH分别调整pH为3.00、4.00、5.00，混匀后参照1.2.1方法进行样品提取，提取溶液待进一步净化。

表1 四环素类药物的相关质谱参数Tab.1 Mass spectrum parameters of tetracyclines

注：*定量离子。

结果发现当pH为4.00时，目标四环素类药物在水中的溶解性最好，对应回收率普遍较高，重现性较好，与文献[10]报道的结果吻合。因此，本研究选择提取溶液的pH为4.00。另外，对提取次数进行优化，对比了20 mL提取液一次提取、分别10 mL提取液两次提取以及以8 mL、6 mL和6 mL提取液分3次提取的效果。提取效率差异表明为达到较好的回收率，需要少量多次提取。图1对比表明在海参样品提取液中加入醋酸铅离心静置后，上层有机相较澄清，在下一步固相萃取净化过程中上样更为顺畅，大大节省了样品处理时间。

图1 海参样品中醋酸铅沉淀蛋白效果比较(A)：未加醋酸铅；(B)：加醋酸铅。Fig.1 Comparison of precipitation effect of proteins by lead acetate in sea cucumber samples(A) Sample without lead acetate；(B) Sample with lead acetate.

2.1.2 净化方式优化

由于鳗基质油脂大分子较多，在上样过程中极易阻塞固相萃取材料孔径，导致上样速度降低，本研究通过使用正己烷对提取液两次除脂后再上柱(图2)，可提高上样速度，同时没有明显降低四环素类药物的回收率。另外，实验对比了Waters Oasis HLB小柱和岛津技迩Pharma小柱的萃取效果，结果表明两类小柱对4类四环素药物的回收率没有较大差异，均可达到70%以上，使用过程可相互替代。本研究分别考察了不同比例甲醇和乙酸乙酯对四环素类药物的洗脱效果，结果表明中等极性的乙酸乙酯对四环素类药物的洗脱能力最强，然而同时会引入少量杂质干扰，因此本研究选用甲醇:乙酸乙酯(1 ∶9，V/V)作为洗脱剂配比，调节洗脱剂极性。另外，分别优化3.00、5.00和8.00 mL几种不同洗脱量对回收率的影响，发现5.00 mL洗脱对目标物的回收率已经达到70%以上，当洗脱量增大后，氮吹浓缩时间会增长，回收率没有明显增加，因此本实验选择洗脱剂量为5.00 mL。

图2 鳗鲡样品中正己烷净化效果比较(A)：提取液未净化；(B)：正己烷一次净化；(C)：正己烷二次净化。Fig.2 Comparison of purification effect by n-hexane in eel samples(A): Sample without purification; (B)：Sample purified with n-hexane once;(C): Sample purified with n-hexane twice.

2.2 仪器条件优化

2.2.1 流动相优化

对比文献[10-12]，通过调整流动相组成和洗脱程序优化色谱峰型。在流动相的水相中加入醋酸铵、甲酸等，可以提高离子化效率，在保持较好分离度的前提下获得理想色谱峰型。对于四环素类药物，通过水相流动相中添加和未添加醋酸铵的峰型比较，发现未加醋酸铵的效果更好；另外，添加甲酸调节峰型，分别比较了0%、0.1%和0.2%甲酸溶液的影响，结果表明添加0.1%的甲酸溶液可以较好地调整峰型，0.2% 甲酸溶液相对于0.1%甲酸流动相，峰型类似，但灵敏度降低，因此，最终选择0.1%甲酸水溶液作为水相流动相。

2.2.2 质谱条件优化

在质谱分析中，由于四环素类药物是两性物质，以正离子方式(ESI+) 进行采集。发现四环素和强力霉素按照文献[10-12]所选定量离子，有较大杂质干扰，且灵敏度相应较低，因此，重新进行一级和二级质谱图扫描，选取丰度相对较强且无杂质干扰的两组离子分别作为各自的定量离子和定性离子(表1)。并采用选择反应监测(SRM)模式优化各质谱参数。

2.3 检出限、回收率和精密度

实验过程发现，用流动相配置标准曲线，水产品不同基质的加标回收率皆大于130%，其中海参样品可能由于多糖等大分子影响，其基质干扰最大。考虑样品基质对于四环素类质谱扫描信号具有增大效应，尝试选择基质标准工作溶液配制标准曲线，得到合适的回收率范围。因此在优化实验条件下，用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质混合标准工作溶液。以每种目标物定量离子的峰面积与质量浓度作标准曲线，在对应范围内线性相关系数皆大于0.995，基质标准曲线见图3。从表2可以看出，分别向空白鲤、鳗、海参和河豚鱼样品中添加药物混合标准溶液，得到方法对4种四环素类药物的最低定量限(LOQ)为5.0 μg/kg (S/N>10)，检出限(LOD)为1.0 μg/kg (S/N>3)，回收率在70.0%～100%之间，相对标准偏差皆小于10%，说明方法的准确性和灵敏度较高，重现性好。同时对于多种水产品中四环素类药物的检测性能差别较小，说明方法适合多种水产品中四环素类药物残留的同时检测。

图3 四环素类的基质标准曲线(A) 土霉素;(B)四环素;(C)金霉素; (D) 强力霉素。Fig.3 Standard curves of tetracyclinesA: OTC; B:TC; C: CTC; D: DOC.

表2 不同水产样品中四环素类药物添加回收率实验

Tab.2 Recoveries of tetracyclines added in different aquatic productsn=6

2.4 样品测定

采用本研究方法分析了采自不同养殖区的28个鳗鲡样品。结果表明，28个样品中有3个样品四环素类药物超出检出限，分别为土霉素含量2.6 μg/kg、3.2 μg/kg和四环素含量4.7 μg/kg，但都未超过国家限量值(100 μg/kg)[1]，空白鳗和加标样品的多反应监测(MRM)见图4。

图4 空白(A)和四环素类药物加标鳗样品(B)的色谱图Fig.4 MRM chromatogram of blank (A) and TCs drugs spiked eel samples (10 μg·kg-1) (B)

3 结论

本方法采用含EDTA的弱酸性MCI缓冲盐提取，结合醋酸铅沉淀蛋白方法，并正己烷和固相萃取技术(SPE)同时净化，建立了不同水产品组织中四环素类药物残留的液相色谱串联质谱联用检测方法。结果表明方法具有较高的灵敏度，检出限和定量限分别为1.0和5.0 μg/kg，同时选用3个不同浓度的加标实验，回收率皆为70%～100%，方法的重现性较好，已成功应用于实际养殖鳗鲡样品中四环素类药物的检测。分析方法操作简便、高效、经济、灵敏度和准确度高，并易于普及。

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Determination of tetracyc1ines antibiotics in different aquatic products tissue by solid phase extraction-liquid chromatography coupled with tandem masss pectrometry

SUN Xiaojie1, LI Zhaoxin1*, DONG Xiao1,2, XING Lihong1,ZHU Fulan3, ZHAI Yuxiu1

(1.Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071,China;2. College of Food Science and Technology, Ocean University of Shanghai 201306,China; 3. SHIMADZU-GL Sciences (Shanghai) Laboratory Supplies CO.,LTD. Shanghai 200052,China)

A method for determination of tetracyc1ines (TCs) antibiotics in aquatic products tissue was developed by solid-phase extraction (SPE) coupled with liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The target analytes were extracted from the aquatic products using the Mcllvaine buffer solution. The proteins in samples were precipitated by lead acetate. Then the samples were cleaned-up throughn-hexane combined with Oasis HLB solid phase extraction. LC-MS/MS in multiple reaction monitoring (MRM) mode was performed for the simultaneous qualitative and matrix external standard quantitative analysis of 4 kinds of tetracyc1ines antibiotics in eel tissues. The results showed that the good linearity was obtained in the corresponding range of all target analytes, with detection limits of 1.00 μg/kg and quantity limits of 5.00 μg /kg. The average recoveries for 4 kinds of tetracyc1ines antibiotics were between 70.0% ～ 100% at different spiking levels in blank eel, cyprinoid, sea cucumber and puffer fish matrices. The relative standard deviations (RSD) were all less than 10% (n=6). The presented method has high sensitivity, good reproducibility and is suitable for detection of residual TCs antibiotics residues in the aquatic products. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(3):44-51]

aquatic products; tetracyc1ines (TCs); solid phase extraction (SPE); liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)

LI Zhaoxin, lizx@ysfri.ac.cn

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.03.007

2016-12-09；接收日期：2017-03-26

中国水产科学研究院黄海水产研究所基本科研业务费(No. 20603022016007)，国家自然科学基金项目(No.21207162)，山东省农业重大应用技术创新项目(No. SF1405303301)，农业部行业标准(No. 2015-403)

孙晓杰 (1984-)，女，博士，助理研究员，研究方向为水产品安全与质量检测，sunxj@ysfri.ac.cn 通信作者：李兆新，研究员，研究方向为水产品安全与质量控制，lizx@ysfri.ac.cn

S91；O658

A

2095-1833(2017)03-0044-07