超高效液相色谱串联质谱法测定水产养殖水体中49种兽药的残留量

赵东豪，王强，王旭峰，黎智广，黄珂，李刘冬

(中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(广州)，农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心(广州)，广东 广州 510300)



超高效液相色谱串联质谱法测定水产养殖水体中49种兽药的残留量

赵东豪，王强，王旭峰，黎智广，黄珂，李刘冬*

(中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(广州)，农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心(广州)，广东 广州 510300)

建立了超高效液相色谱串联质谱测定水产养殖水体中硝基呋喃类、磺胺类、氟喹诺酮类、大环内酯类等11类、49种药物的分析方法。样品分别采用固相萃取法和冷冻干燥法浓缩后，经Kinetex C18色谱柱分离，乙腈和0.1%甲酸水作为流动相梯度洗脱，正负离子同时扫描，多时段-多反应监测模式下测定，外标法定量。各种药物在相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.998。冷冻干燥法各种药物的方法检出限为5～30 ng/L，加标回收率为63.1%～120%，相对标准偏差<15.2%。固相萃取法各种药物的方法检出限为1～5 ng/L，除孔雀石绿类外，加标回收率为67.1%～119%，相对标准偏差<13.6%。方法灵敏度高、重现性好，适用于测定水产养殖场池塘水样中残留的多种类药物。[中国渔业质量与标准，2017,7(3):30-37]

兽药；水样；多残留检测；固相萃取法；冷冻干燥法；超高效液相色谱串联质谱

水产养殖过程中，为预防或治疗鱼、虾等动物的细菌性疾病，减少经济损失，相关从业人员经常会使用磺胺类、四环素类、大环内酯类等抗菌药物[1-2]，甚至硝基呋喃类、孔雀石绿类、氯霉素类、氟喹诺酮类等违禁药物在水产品中也屡有检出[3-4]。与畜禽养殖不同，水产养殖不管是将药物混合在饲料中饲喂，还是直接往池塘中泼洒，药物都会溶于水体，而水中残留的药物会在换水时污染周围的河流、湖泊等自然水域[5]。王丹等[6]研究结果表明，在中国地表水环境中已检出磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类等68种抗菌药物。虽然如此种类众多的抗菌药物残留并不完全与水产养殖业相关[7-8]，但水产养殖过程中抗菌药物的不合理使用，仍是其中一种不容忽略的因素[9]。水体环境中抗菌药物较高浓度的残留，会影响生态环境的平衡[10]，还可能诱导细菌耐药性[11]，危害人类健康[12-13]。

目前，关于水产品中硝基呋喃类、磺胺类、氟喹诺酮类、孔雀石绿类和氯霉素类等禁限用药物的残留检测方法研究比较多[14]，主要采用高效液相色谱法(HPLC)[15-16]和液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定某类药物，或者同时测定少数几类药物[17-18]。与水产品等复杂生物基质样品相比，水样的基质相对来说比较简单，不用太多的提取步骤，大多只需经过简单的浓缩与净化处理，即可上机测定。因此，一次样品处理，同时测定水样中残留的多种类药物成为可能[19]。鉴于目前水产养殖过程的药物使用情况，为了更加方便、有效地监控多种类药物的使用，评估其对水产品的质量安全风险，本研究选择文献报导较多的硝基呋喃类、磺胺类、氟喹诺酮类、大环内酯类、林可霉素、沃尼妙林、甲基睾酮、孔雀石绿类、四环素类、喹噁啉类以及氯霉素类等11类药物作为研究对象，分别采用固相萃取法和冷冻干燥法浓缩、富集水产养殖场池塘水体中残留的痕量药物，结合超高效液相色谱-串联质谱法测定，建立了水产养殖水体中49种药物残留量的分析方法，为监控水产养殖过程中多种类药物的使用情况，评估其对水产品的质量安全风险提供实用的检测手段。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

Acquity UPLC I-Class/Xevo TQS超高效液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪(配备电喷雾离子源及Masslynx数据处理软件)购于美国Waters公司；5810型台式离心机购于德国Eppendorf公司；MS3旋涡混合器购于德国IKA公司；ALPHA 2-4 LSC冷冻干燥机购于德国Christ公司；Milli Q去离子水发生器购于美国Millipore公司；N-EVAP氮吹仪购于美国Organomation公司；20管真空固相萃取仪购于美国Waters公司。

1.2 实验试剂

磺胺类、氟喹诺酮类等多种兽药标准品，纯度≥95%(Dr. Ehrenstorfer)；Oasis HLB固相萃取小柱(500 mg/6 mL)购于美国Waters公司；乙腈、甲酸为色谱纯，购于美国Sigma-Aldrich公司，Na2EDTA(分析纯)购于广州化学试剂厂，用水配制成1 g/L的溶液，用甲酸调节pH至3.0。

1.3 测定方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Phenomenex Kinetex C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温为40 ℃；进样量为10 μL；流速为0.3 mL/min；流动相为乙腈(A)和0.1%甲酸水溶液(B)。梯度洗脱程序为0～5 min，10%～50% A；5～7.5 min，50%～95% A；7.5～9 min，95% A；9～9.5 min，95%～10% A；9.5～11 min，10% A。

1.3.2 质谱条件

离子源为电喷雾电离(ESI)；扫描方式为正负离子同时扫描；离子源温度为150 ℃；毛细管电压为3.0 kV；脱溶剂气温度为350 ℃；脱溶剂气流量为750 L/h；碰撞气流速为0.15 mL/min，锥孔反吹气流量为150 L/h；监测方式为多时段-多反应监测(multiple-period MRM)。

表1 49种化合物的MRM离子对及质谱条件参数Tab.1 MRM transition and mass spectrometric parameters for the 49 analytes

续表1 Tab.1 continued

注：*表示定量离子。

1.4 样品前处理

1.4.1 水样的采集与过滤

从水面下约0.5 m处采集5 L水样，装于玻璃瓶中，静置沉淀后，先用2 μm的玻璃纤维膜过滤去除较大杂质，再经0.45 μm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤后，备用。

1.4.2 样品的浓缩

1.4.2.1 固相萃取法

准确量取100 mL过滤后的水样，加入0.4 g Na2EDTA，用甲酸调节溶液pH至约3.0[20]，采用Waters Oasis HLB(500 mg，6 mL)固相萃取柱富集和净化。依次用6 mL甲醇和6 mL水活化小柱后，再用6 mL Na2EDTA溶液平衡。将上述待测水样以约1 mL/min的速率过柱，弃流出液，用6 mL水淋洗后压干，再用8 mL甲醇洗脱，洗脱液于40 ℃水浴下氮气吹干，用乙腈-0.1%甲酸水溶液(10∶90，V/V)定容至1 mL，经0.22 μm滤膜过滤后上机测定。

1.4.2.2 冷冻干燥法

准确量取20 mL过滤后的水样于50 mL聚丙烯离心管中，置于-80 ℃超低温冰箱，约1 h后完全冻结。冷冻干燥机泵提前预热约20～30 min，将已经冻结的水样转移至冻干机的样品仓，在Main Drying模式下真空冷冻干燥约40 h，样品仓温度保持在-83 ℃，大气压为6 Pa。待测样品全部冻干后，加入1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(10∶90，V/V)，超声波溶解10 min，涡旋振荡1 min，以20 000 g高速离心10 min后，经0.22 μm滤膜过滤后上机测定。

2 结果与分析

2.1 固相萃取柱的选择

将待测的49种药物的混合标准溶液添加至100 mL空白水样中，以回收率作为评价指标，对固相萃取小柱类型和萃取条件进行筛选比较。本研究所测定的对象包括硝基呋喃类、磺胺类、氟喹诺酮类、大环内酯类、林可霉素、沃尼妙林、甲基睾酮、孔雀石绿类(含结晶紫及其代谢物)、四环素类、喹噁啉类以及氯霉素等11类药物，这些化合物的理化性质各异，为了对以上所有药物都能取得理想的检测效果，选取通用型固相萃取柱HLB小柱和C18小柱对水体中的11类药物进行浓缩与富集。结果表明，使用C18小柱时，硝基呋喃类药物(NFZ、FZD和NFT)的漏穿率为6%～29%，磺胺类药物(SD、ST、SM1、SM2和SMO)漏穿率为3%～36%，四环素类药物(DO和OTC)虽未漏穿，但是回收率小于30%；而HLB小柱对所有的药物均具有较好的保留效果，除孔雀石绿类化合物的回收率偏低外，用8 mL甲醇即可将其他种类的药物从500 mg的HLB小柱上洗脱下来，回收率均大于67%。

孔雀石绿类化合物比较适合用PRS或MCX等阳离子交换柱净化[21-22]，使用HLB小柱浓缩该类药物时，将洗脱液由甲醇更换为洗脱能力更强的乙腈，可以有效洗脱孔雀石绿，但对隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫等3种化合物的洗脱效果仍不理想，其中的原因有待进一步的研究。

四环素类药物易与金属元素形成配合物或螯合物，在水样中加入Na2EDTA溶液，可以竞争性地与多种金属螯合，降低重金属对四环素类药物检测的影响，提高回收率[23]。对于恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星等7位引入哌嗪环的喹诺酮类药物，将样品的pH调至酸性过柱，药物的哌嗪环能与HLB的填料形成氢键，增强药物在小柱上的保留，而这种现象在氟甲喹等不含哌嗪环的喹诺酮类药物上则未发现[20]。为提高药物的回收率，将样品的pH调至约3.0。

2.2 冷冻干燥法的优缺点

由于孔雀石绿类药物难以从HLB小柱上有效洗脱，回收率较低，本研究又建立了冷冻干燥法浓缩样品，同时检测11类药物。与固相萃取、减压蒸干等样品浓缩方法相比，冷冻干燥法操作简单，浓缩过程中不需要使用有机溶剂，成本低且对环境的污染小。测定样品时直接将水样分装放置于冷冻干燥机中即可，处理过程中目标化合物损失少，回收率较高。本研究将添加11类化合物的水样冻干后，各种药物的回收率均>63%，可以满足水样中多类药物同时检测的需要。但冻干法比较慢，本研究将20 mL水样冻干，耗时近2 d，如果冻干更多体积的样品，则需时更久，工作效率稍低。尤其是在样品量多、时间紧的情况下，冻干法难以完成检测任务。此外，冻干法处理的样品基质较脏，尽管液质法具有特异性强的优势，被杂质干扰的可能性较小，但检测过程中仍需注意基质效应对定量分析的影响。因此，在实际工作中，检测人员可以根据待测的药物种类、样品数量及时间限制等因素，灵活选择固相萃取法或冷冻干燥法进行样品处理。

2.3 色谱和质谱条件的优化

使用ESI质谱测定时，在流动相中添加甲酸或乙酸有助于正电离，负电离时添加氨水等碱性物质则能提高待测物的灵敏度。本研究涉及的49种药物，除氯霉素、氟苯尼考等少数几种药物负电离时具有更高的灵敏度，其他药物正电离的效果最佳。为了提高大部分药物的灵敏度，在样品中添加了0.1%的甲酸，尽管氯霉素和氟苯尼考的灵敏度有所降低，但仍可满足检测的要求。呋喃西林和呋喃妥因为两性化合物[3]，正负离子扫描均可，当样品的pH为酸性时，两者在正离子模式下也具有较高的灵敏度。因此，本研究采用正负离子同时扫描的模式测定，除氯霉素和氟苯尼考采用负电离外，其他药物均使用正离子模式扫描。

与高效液相色谱法相比，液相色谱串联质谱法对色谱峰之间的分离度要求较低。但同一时间段内通过质量分析器的离子太多，会缩短目标离子在检测器的驻留时间，影响待测物的峰形。本研究利用各种化合物的极性差别，借助柱效较高的粒度为1.7 μm的Kinetex C18色谱柱，以乙腈和0.1%甲酸水溶液作为流动相，采用梯度洗脱法，使各目标物的保留时间分散在1～7 min，在获得适当保留和理想分离效果的同时，峰形尖锐，灵敏度高。11类化合物中代表性药物的MRM离子流图见表1。

图1 固相萃取法处理的水样中添加0.5 μg·L-1代表性药物的MRM离子流图Fig.1 MRM chromatograms of typical analytes fortified in water samples at 0.5 μg·L-1 which were treated by solid phase extraction

驻留时间对化合物的峰形影响很大。通常情况下，每个峰至少需要采集12个数据点，才能使其具有良好的重现性，否则易因峰形失真，影响峰面积而使定量结果偏差较大。当待测物数量较少时，每个通道的采集方式对检测结果可能影响不大，但本研究同时测定49种药物，同一时间段监测的离子数量较多，为提高定量分析的准确度和精密度，在梯度洗脱的基础上，根据每个目标峰的保留时间，采用分段采集的方式进行MRM扫描，软件自动分配驻留时间，尽可能使每个色谱峰都能采集较多的数据点。

2.4 方法学考察

配制6个浓度水平的标准溶液，按优化的色谱和质谱条件上机测定。以各个药物的色谱峰面积为纵坐标，以其所对应的浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。以标准添加法制备样品，分别采用固相萃取法和冷冻干燥法处理后测定，以定量离子信噪比(S/N)大于3得到方法的检出限(LOD)。选取实验室制备的超纯水作为空白测试基质，添加3个浓度水平的加标样品，其中最小的加标浓度，为样品浓缩后该药物线性范围的下限(表2和表3)，每个浓度水平做5个重复，并做空白对照实验，按照1.4节所述方法处理后上机测定，计算出各种药物的加标回收率和相对标准偏差。

结果表明，11类药物在相应的质量浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数>0.998。采用固相萃取法，各待测物被浓缩100倍后，水体中11类药物的检出限为1～ 5 ng/L，加标回收率除孔雀石绿类较低外，其他药物为67.1%～119%，相对标准偏差<13.6%。冷冻干燥法将各待测物浓缩了20倍，水体中11类药物的检出限为5 ～ 30 ng/L，加标回收率为63.1%～120%，相对标准偏差<15.2%。

与大多数水产品的检测方法不同，水样中的药物浓度可能比较低，需要经过浓缩后上机，才能检测出其中残留的痕量药物，因此水样的方法检出限常远低于仪器检出限。水样中的药物浓缩后，浓度落在线性范围内，即可进行定量分析。

表2 HLB小柱萃取水样中11类药物的检出限、回收率和精密度Tab.2 Limits of detection, recoveries and precision of 11 classes of drug in water samples treated by solid phase extraction with HLB cartridge n=5

表3 冷冻干燥法处理的水样中11类药物的检出限、回收率和精密度Tab.3 Limits of detection, recoveries and precision of 11 classes of drug in water samples treated lyophilization n= 5

2.5 实际样品测定

从广东省水产养殖场采集养殖水10份，用建立的方法对水样进行前处理和上机测定。结果表明，3份水样中检出了恩诺沙星、环丙沙星和磺胺甲噁唑等药物，质量浓度为117～376 ng/L。

3 结论

本研究建立了水产养殖水体中硝基呋喃类、磺胺类、氟喹诺酮类、大环内酯类、林可霉素、沃尼妙林、甲基睾酮、孔雀石绿类、四环素类、喹噁啉类以及氯霉素类等11类、49种药物残留量的分析方法，样品分别采用固相萃取法和冷冻干燥法浓缩后，经超高效液相色谱-串联质谱法测定。方法灵敏度高、重现性好，适用于测定水产养殖场池塘水样中残留的多种类药物。

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Determination of 49 veterinary drug residues in aquaculture water byultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHAO Donghao, WANG Qiang, WANG Xufeng, LI Zhiguang, HUANG Ke, LI Liudong*

(Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation (Guangzhou), Fishery Environment and Aquatic Products Quality Inspection & Testing Center of the Ministry of Agriculture (Guangzhou), South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China)

An accurate, sensitive and reliable ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was developed for the simultaneous determination of 49 veterinary drugs in water samples. The samples were enriched by solid phase extraction and lyophilization, respectively. Chromatography separation was performed on a Kinetex C18column under gradient elution condition utilizing acetonitrile and 0.1% formic acid as mobile phases. The compounds were quantitated with external standard method in the multiple-period multiple reaction monitoring (MRM) mode using both positive and negative electrospray ionization. The good linearity was achieved in the corresponding concentration range of each analyte and the coefficient of correlation (r) was greater than 0.998. The limits of detection (LOD) were in the range of 5～30 ng/L, and the recoveries of analytes in spiked samples were between 63.1% and 120% with relative standard deviations (RSD) less than 15.2% by lyophilization. The LODs were in the range of 1～5 ng/L, and the recoveries of analytes (except for triphenylmethane dyes) in spiked samples were between 67.1% and 119% with RSDs less than 13.6% by solid phase extraction. The proposed method can be applied to the determination of 49 veterinary drugs in real water samples. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(3):30-37]

veterinary drugs; water; multi-residue determination; solid phase extraction; lyophilization; ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS/MS)

LI Liudong, 168lld@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.03.005

2017-02-22；接收日期：2017-03-28

广东省水产品质量安全专项(GDSCZA2015008)；中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助(2014TS28)；国家农产品质量安全风险评估重大专项(GJFP201501003)

赵东豪(1981-)，男，博士，助理研究员，研究方向为水产品质量安全与风险评估， donghaozhao@126.com 通信作者：李刘冬，研究员，研究方向为水产品质量安全与风险评估方向的研究，168lld@163.com

S91;O657.63

A

2095-1833(2017)03-0030-08