双膦酸盐类药物对胃癌细胞生长增殖的作用机制

徐晓宁 马晓贞 汪学昌 李生梅 冶国栋

(青海大学附属医院肿瘤内科，青海 西宁 810001)



双膦酸盐类药物对胃癌细胞生长增殖的作用机制

徐晓宁 马晓贞 汪学昌 李生梅 冶国栋

(青海大学附属医院肿瘤内科，青海 西宁 810001)

目的 检测双膦酸盐类药物唑来膦酸对胃癌细胞生长增殖的研究机制。方法 培养人胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901和BGC-823，将细胞分为对照组和药物处理组，MTT法检测10、20、40、80 μmol/L唑来膦酸对细胞株的影响。人胃癌细胞株加入10～80 μmol/L的唑来膦酸，对照组不加药物，孵育1、3、6、12、24 h后计算不同浓度和时间对细胞的影响；人胃癌细胞株SGC-7901加入40 μmol/L的唑来膦酸培养24 h后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，Western印迹检测半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9、Bcl-2蛋白的表达。结果 10、20、40、80 μmol/L的唑来膦酸作用于胃癌细胞株(BGC-823、SGC-7901、MKN-28)，唑来膦酸的半抑制浓度(IC50)为40 μmol/L，用10～80 μmol/L的唑来膦酸作用于BGC-823、SGC-7901、MKN-28胃癌细胞株1、3、6、12、24 h后，可见唑来膦酸抑制人胃癌细胞的生长且有时间和浓度的依赖性，唑来膦酸对胃癌正常黏膜细胞GES-1无抑制作用；人胃癌细胞SGC-7901经40 μmol/L的唑来膦酸作用24 h后，流式细胞仪检测发现唑来膦酸处理组细胞凋亡情况显著高于对照组；经40 μmol/L唑来膦酸作用后的人胃癌细胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白表达量明显升高，而Bcl-2蛋白表达量与对照组相比明显减少。结论 唑来膦酸能抑制胃癌细胞的生长且有时间和剂量依赖性，唑来膦酸可以促进细胞凋亡。

双膦酸盐类药物；唑来膦酸；胃癌

近年来，虽然胃癌的发病率有所下降，但胃癌患者预后恢复情况仍无明显改变，病后5年的生存率还是很低。对于进展期和晚期的胃癌患者，化疗是主要的手段，但化疗药物副作用、局限性大〔1～3〕。双膦酸盐类药物(Bps)是一种代谢性骨病药物，多用于治疗由多种原因引起的骨溶解性疾病〔4〕。近年来，研究者又发现了Bps对抗肿瘤有直接或间接的作用〔5〕。唑来膦酸是第3代Bps，随着对Bps研究的不断深入，研究者发现唑来膦酸也能很好地对前列腺癌、肺癌等恶性肿瘤进行治疗，但对胃癌的研究还比较少〔6,7〕。本研究旨在探讨Bps对胃癌细胞生长增殖的影响。

1 材料和方法

1.1 试验材料 细胞株:人胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823和GES-1由青海大学实验室提供。主要试剂:兔抗Bcl-2多克隆抗体、兔抗半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3多克隆抗体、兔抗Caspase-9多克隆抗体、鼠抗β-actin单克隆抗体、Caspase-3 活性测定试剂盒和Caspase-9活性测定试剂盒购自美国Bioworld，Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒购自美国Invitrogen，ELISA细胞凋亡试剂盒购自瑞士Roche公司，RPMI1640购自美国Gibco公司。主要仪器:酶联免疫检测仪购自美国Thermo，流式细胞仪购自美国B-D公司。

1.2 细胞的培养 从-80℃冰箱中取出人胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823，37℃融化后，将细胞培养在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中，37℃、5% CO2、95%空气饱和湿度条件下培养，用NaHCO3调整pH至7.2～7.4，细胞达到85%融合后，加入0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA消化分离细胞进行传代培养。

1.3 不同时间不同浓度的唑来膦酸对细胞的影响 将细胞分为对照组、药物作用组。将人胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823培养至对数生长期，用胰酶消化并计数后，用培养液稀释为终浓度3×104个/ml，按照每个孔100 μl的量接种于96孔培养板中，37℃、5%CO2培养箱中过夜。在细胞中加入10、20、40、80 μmol/L的唑来膦酸，对照组不加药物，置于37℃ CO2培养箱中孵育1、3、6、12、24 h后，离心收集细胞，重悬于不同浓度药物中。向每孔中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续培养4 h，1 500 r/min离心10 min，弃上清，每孔加入DMSO 150 μl，摇床室温下缓慢震荡8 min，待结晶物充分溶解后用酶标仪在570 nm的波长处测定并记录各组的吸光度OD，计算唑来膦酸的半数抑制浓度(IC50)及抑制率。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期的人胃癌细胞株SGC-7901加入40 μmol/L的唑来膦酸，对照组不加药物，置于CO2培养箱中，37℃孵育24 h，用胰酶消化并收集细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)调整待测细胞浓度为3×106个/ml。取1 ml细胞悬液至离心管中，4℃1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 ml冰预冷的PBS重悬细胞，再次离心弃上清，PBS重复洗涤一次，加入Binding Buffer 200 μl重悬细胞，分别加入5 μl Annexin-V和PI,充分混匀后避光环境中室温静置20 min，加缓冲液300 μl，用流式细胞仪观察细胞凋亡情况。

1.5 Western印迹检测相关蛋白表达 将40 μmol/L唑来膦酸作用于人胃癌细胞24 h后，转移到1.5 ml的Ep管中，根据细胞的数量，加入适宜量的裂解缓冲液，裂解30 min，12 000 r/min、4℃离心10 min，取上清。按照细胞总蛋白提取试剂盒和蛋白浓度测定试剂盒提取蛋白和测定蛋白浓度，在蛋白样品与上样缓冲液充分混合后，100℃煮沸变性5 min，每孔中加50 μl样品，通过Odyssey扫描系统分析蛋白表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 不同浓度唑来膦酸不同时间对人胃癌细胞抑制作用 用10～80 μmol/L的唑来膦酸作用于BGC-823、SGC-7901、MKN-28胃癌细胞株1、3、6、12、24 h小后，可见唑来膦酸抑制人胃癌细胞的生长且有时间和浓度的依赖性，唑来膦酸对胃癌正常黏膜细胞GES-1无抑制作用。见图1。

图1 不同浓度唑来膦酸不同时间对人胃癌细胞的影响

2.2 不同浓度唑来膦酸对细胞的影响 BGC-823、SGC-7901、MKN-28的IC50分别为(35.12±2.88) μmol/L、(38.52±3.21) μmol/L、(33.22±1.67) μmol/L。唑来膦酸对SGC-7901细胞株的IC50为40 μmol/L，24 h的抑制效果最明显，因此后期选用浓度为40 μmol/L，培养24 h的人胃癌细胞SGC-7901为研究对象。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 人胃癌细胞SGC-7901经40 μmol/L的唑来膦酸作用24 h后，经PI/ Annexin-V双染色用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。唑来膦酸处理组细胞凋亡(15.53%±1.11%)显著高于对照组(2.12%±0.66%)(P<0.01)。

2.4 Western印迹检测相关蛋白表达 经40 μmol/L的唑来膦酸作用后的人胃癌细胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白表达量(0.346±0.021，0.321±0.025)与对照组(0.208±0.015，0.198±0.018)相比明显升高，而Bcl-2蛋白表达量(0.195±0.029)与对照组(0.324±0.031)相比明显减少(P<0.01)。见图2。

图2 唑来膦酸作用于人胃癌细胞后相关蛋白表达量

3 讨 论

目前，对胃癌的治疗主要采取化疗的方式，然而一部分胃癌细胞对化疗药物会产生耐药性，从而导致化疗的失败，这一直是困扰临床治疗的一个棘手问题〔1,8〕。因此，找到一个治疗胃癌效果好的药物，尽量减少化疗是解决问题的关键。

Bps是近40年发展起来的一类对抗代谢性骨病有重要作用的药物，如由多种因素引起的骨质疏松、恶性肿瘤转移、骨痛等〔9〕。目前，Bps已经更新到第3代〔10〕，随着研究的不断深入，发现Bps不仅对破骨细胞有作用，而且还有直接的抗肿瘤效果，对多发性的胰腺癌、乳腺癌等肿瘤疾病都有直接的抗肿瘤效果〔11,12〕。研究者进一步的研究发现Bps的直接抗肿瘤作用主要是通过抑制肿瘤生长同时诱导凋亡来完成的〔13〕。

Bcl-2家族是细胞凋亡过程中重要的调控因子，目前已经发现了Bcl-2家族20种蛋白质：一类是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL等10多个成员，另一类是促凋亡蛋白，包括Bax、BAD等10多个成员〔14,15〕。Bcl-2家族中主要的抗凋亡分子是Bcl-2和Bcl-xL。Bcl-2和Bcl-xL能通过自身的BH3结构域与Bcl-2家族的促凋亡蛋白形成二聚体，促使促凋亡成员在细胞内定位分布，从而保护细胞不进入凋亡程序〔16,17〕。本研究结果显示，人胃癌细胞株经40 μmol/L的唑来膦酸处理后，Bcl-2蛋白表达量明显减少。

Caspase 家族是细胞凋亡过程中重要的效应子。目前已发现了14种Caspase家族成员。Caspase-3是凋亡的效应子，位于级联反应的下游。目前，在Caspase家族中Caspase-3是研究比较透彻的一个。一般情况下，胞质中的Caspase-3以无活性的酶原形式存在，当出现细胞凋亡信号时可引起Caspase-3在一些水解酶的作用下发生裂解而活化〔18,19〕。Caspase-9是Caspase家族中的启动分子，在人类的正常组织广泛表达。研究表明，在白血病、胃癌中都发现Caspase-9基因转录和翻译下调〔20〕。本研究结果推测唑来膦酸诱导的细胞凋亡是通过Caspase家族的依赖途径发挥作用。

综上所述，唑来膦酸在胃癌细胞的生长增殖发挥重要作用且有时间和剂量的依赖性。唑来膦酸可以促进细胞凋亡，作用机制与Bcl-2蛋白家族和Caspase级联反应有关。

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〔2016-08-02修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)

徐晓宁(1978-)，女，主治医师，主要从事肿瘤内科化疗研究。

R73

A

1005-9202(2017)14-3429-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.021