VEGFR-2靶向超顺磁性氧化铁磁性纳米探针构建及肝癌细胞磁共振分子成像

梅 苹 全姬善 宋晓伟 延光海 金恩浩 金光玉

(延边大学附属医院影像一科，吉林 延吉 133000)



VEGFR-2靶向超顺磁性氧化铁磁性纳米探针构建及肝癌细胞磁共振分子成像

梅 苹 全姬善1宋晓伟 延光海2金恩浩 金光玉

(延边大学附属医院影像一科，吉林 延吉 133000)

目的 制备血管内皮生长因子受体(VEGFR)-2靶向磁共振(MR)分子探针，探讨其对肝癌细胞的特异性靶向作用。方法 采用共沉淀法制备超顺磁性氧化铁(SPIO)，用壳聚糖对其表面进行修饰，耦联anti-VEGFR2抗体，制备VEGFR-2靶向MR分子探针(anti-VEGFR2-CS@SPION)，以未修饰的SPIO纳米粒作为对照组。DLS法测量粒径大小、分布及Zeta电位，3.0T MR检测T2弛豫率。MTT法评价探针的安全性，通过激光共聚焦显微镜检测以及普鲁士蓝染色的方法验证探针与肝癌细胞结合的特异性。3.0T MR观察探针的体外MR成像能力。结果 SPIO和anti-VEGFR2-CS@SPION的粒径分别为 20.6 nm和38.4 nm；Zeta电位分别为-(20.3±1.32)mV、(3.58±1.28)mV。T2弛豫率分别为0.179×106M-1S-1、0.201×106M-1S-1。细胞毒性实验表明探针在高浓度下对细胞没有毒性；激光共聚焦显微镜检测显示，抗体探针与HepG2细胞特异性结合；anti-VEGFR2-CS@SPION与HepG2细胞孵育后经普鲁士蓝染色，细胞内见较多的蓝染颗粒，而单纯SPIO组细胞内未见蓝色颗粒。体外MR成像显示，anti-VEGFR2-CS@SPION组、单纯SPIO组和空白对照组的T2值分别为(55.6± 1.4)ms、(99.8±0.77)ms和(110.8±0.95)ms，差异有统计学意义(F=317.547，P<0.01)。结论 壳聚糖修饰和SPIO标记的anti-VEGFR2抗体探针具有良好的生物学特性和体外肝癌细胞MR显像能力。

VEGFR-2；超顺磁性氧化铁；壳聚糖；肿瘤靶向；磁共振分子成像

磁共振(MR)分子成像可以实现肝癌特异性诊断和早期检测。血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)是重要的血管生成显像剂，VEGF与VEGFR在肿瘤细胞的表达程度与肿瘤新生血管的增殖、侵袭、转移及预后相关〔1〕。VEGF可以与3种特异性VEGFR结合，其中VEGFR-2是血管内皮细胞表面与VEGF反应的主要受体，VEGF与VEGFR-2相互作用而调节生理或病理条件下新生血管的生成〔2〕。恶性肿瘤中存在VEGFR的高表达，而在正常组织中局限表达特性使其成为肿瘤诊断和免疫治疗理想的靶分子。超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米粒具有良好的生物安全性，可以连接抗体、蛋白质、药物等特异地靶向作用于肿瘤，实现MR靶向诊断和治疗〔3〕。壳聚糖是天然高分子多糖，具有氨基和羟基基团，修饰氧化铁纳米粒表面使其具有亲水性、生物相容性及稳定性，并有抗肿瘤、强化肝功能等多种药理活性〔4〕。本研究利用VEGFR-2抗体主动靶向的特性，以壳聚糖为修饰材料，标记SPIO构建VEGFR-2靶向MR分子成像探针，体外探测其对肝癌细胞的靶向效果，为肝癌的MR特异性分子成像提供基础。

1 材料与方法

1.1 VEGFR-2靶向MR分子探针的制备及表征

1.1.1 分子探针的构建 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 购自Pierce 公司。利用共沉淀法制备磁性氧化铁纳米颗粒，用壳聚糖对其表面进行修饰。将0.2 g壳聚糖加入到1%(V/V)的醋酸水溶液中，充分溶解后，加入一定量的经充分超声分散的SPIO 0.5 ml，室温下搅拌4 h后，磁分离法洗涤4～5遍，4℃下保存备用。

利用化学耦联剂EDC/NHS制备免疫磁性纳米探针。取0.2 mg CS-SPION用双蒸水磁分离洗涤3遍后，用1 ml 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液(0.1 mol/L，pH4.7)重悬并超声分散，然后加入适量的经过EDC/NHS活化的VEGFR-2抗体，混匀，室温下轻轻摇动2 h。将混合物用PBS磁分离洗涤3次，以除去游离抗体，然后将磁性纳米颗粒重悬于含10 g/L PEG-COOH的PBS溶液中，室温振荡2 h。同样进行磁分离洗涤除去游离分子，最后重悬于等体积的PBS(0.1 mol/L，pH7.4)中，4℃保存。

1.1.2 分子探针的表征 探针合成后，利用激光纳米粒度仪测量SPIO及anti-VEGFR2-CS@SPION的粒径及Zeta电位。

1.2 T2弛豫率测量 anti-VEGFR2-CS@SPION与SPIO分别稀释至铁浓度为0.02、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18和0.20 mmol/L的溶液，依次取这些浓度的样品液1 ml置于EP管中，另取1 ml蒸馏水作为对照，应用Philips Verio 3.0T MR扫描仪进行横断位T2 Mapping扫描。将anti-VEGFR2-CS@SPION与SPIO不同铁浓度为横坐标(X)、1/T2为纵坐标(Y)分别作图，得到直线的斜率即anti-VEGFR2-CS@SPION和SPIO的弛豫率。

1.3 细胞存活率检测 应用四甲基偶氮唑(MTT)比色法检测细胞毒性。anti-VEGFR2-CS@SPION和SPIO分别稀释成20、40、60、80 μg/ml。将HepG2细胞以1×104/孔细胞数接种于96孔细胞培养板中，培养24 h，每孔加入MTT溶液25 μl，继续置于培养箱孵育4 h，吸除各孔原液，加DMSO 100 μl，振荡混匀，酶标仪测定540 nm波长各孔光吸收值(OD)。试验中设3个平行样品，重复3次。

1.4 激光共聚焦显微镜检测 将Cy5.5荧光染料耦联至探针，配置铁浓度为40 μg/ml的Cy5.5-anti-VEGFR2-CS@SPION和Cy5.5-SPIO溶液，分别与HepG2细胞孵育1 h后，置于激光共聚焦显微镜下观察。

1.5 普鲁士蓝染色 将生长良好的HepG2细胞制成细胞悬液接种于24孔板内，37℃、5 % CO2条件下孵育24 h后，用PBS洗涤3遍。分别加入anti-VEGFR2探针和SPIO(铁浓度为40 μg/ml)，放入CO2培养箱内孵育，PBS洗涤3遍，用4%多聚甲醛1 ml固定20 min后，置于含2%亚铁氰化钾和2 % 氯化氢混合液避光孵化30 min，用1 % 核固红复染1 min，流水冲洗，置于倒置显微镜下观察。

1.6 体外MR成像 将铁浓度为40 μg/ml的anti-VEGFR2-CS@SPION和SPIO分别与HepG2细胞孵育24 h后，PBS洗涤3遍，0.25 % 胰酶消化后收集细胞悬液，离心，用4%多聚甲醛固定，PBS重悬后，置于EP管中进行MR扫描。未做任何处理的HepG2细胞作为空白对照组。采用Philips Verio 3.0T MR扫描仪进行横断位T2 mapping扫描。SE序列扫描参数为：TR 1 000 ms，TE 分别为16 ms、32 ms、48 ms、64 ms和80 ms，TR 2 500 ms，FOV 12 cm×12 cm，矩阵320 × 300，层厚3 mm，间隔0.6 mm，测量每管内连续3个ROI的T2值，每个ROI测量3次，取平均值。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 磁性纳米粒的表征 激光纳米粒度仪检测，SPIO和anti-VEGFR2-CS@SPION粒度分布较均匀，粒径分别为 20.6 nm、38.4 nm，合成后的抗体探针粒径较SPIO粒径增大，说明抗体成功耦联到SPIO上，见图1。 Zeta电位分别为-(20.3±1.32)mV、(3.58±1.28)mV。

图1 透射电镜下SPIO和anti-VEGFR2-CS@SPION纳米粒的照片

2.2 T2弛豫率 随着铁浓度的增加，anti-VEGFR2-CS@SPION组和SPIO组的T2值逐渐下降，符合MR阴性对比剂的基本特征。anti-VEGFR2-CS@SPION组和SPIO组的T2弛豫率分别为0.201×106M-1S-1、0.179×106M-1S-1。T2弛豫率大，则表明缩短质子驰豫时间的能力越强，在MR图像上造成组织之间的信号差别就越大，即T2信号减低。

2.3 细胞存活率 MTT实验结果表明，anti-VEGFR2-CS@SPION组细胞与SPIO组细胞OD值之间无统计学差异(P>0.05)，在80 μg/ml铁浓度下具有较高的细胞存活率，表明合成的抗体探针具有良好的生物相容性及安全性，见图2。

2.4 激光共聚焦显微镜检测 使用激光共聚焦显微镜观察探针与HepG2细胞的结合情况，结果显示，抗体探针可以特异性与HepG2细胞结合，细胞膜和细胞质内有较多的荧光染色(图3A)，而单纯SPIO未见荧光染色(图3B)。

2.5 普鲁士蓝染色 anti-VEGFR2-CS@SPION与HepG2细胞孵育后，细胞内可见较多的蓝色颗粒(图4A)，而未修饰的SPIO与HepG2细胞孵育后，细胞内未见蓝色颗粒(图4B)。

2.6 体外MR成像 体外MR成像显示，anti-VEGFR2-CS@SPION与HepG2细胞共孵育后明显缩短T2信号，T2信号明显低于SPIO和空白对照组，见图5。anti-VEGFR2-CS@SPION组、单纯SPIO组和空白对照组的T2值分别为(55.6± 1.4)ms、(99.8±0.77)ms和(110.8±0.95)ms，差异有统计学意义(F=317.547，P<0.01)。

图2 MTT法检测探针的细胞毒性

图3 探针与HepG2细胞结合情况(×600)

图4 HepG2细胞与探针孵育后普鲁士蓝染色

图5 细胞体外MR成像

3 讨 论

抗体具有高度特异性和靶向性，通过抗原与抗体的特异性结合，将肿瘤新生血管上某些特异性配体负载顺磁性造影剂SPIO表面，可增加MR分子探针的靶向性与特异性，可以实现肿瘤特异性靶向MR成像。SPIO与抗体结合后不会改变MR显像特性，且毒性低，也不影响体内正常组织的分化，可无创、动态地定量检测肿瘤血管表达，并对肿瘤新生血管进行磁共振显像，是近年来MR分子成像研究的热点〔5，6〕。VEGFR-2是血管内皮细胞表面与VEGF反应的主要受体〔7〕，是调节血管生成、内皮细胞增殖和迁移等的关键调控因子，VEGF/VEGFR-2是目前报道的最重要的血管生成抑制剂作用的靶点〔8〕。壳聚糖是自然界广泛存在的高分子多糖，具有氨基和羟基基团，修饰氧化铁纳米颗粒表面，不仅使纳米粒具有亲水性、生物相容性及稳定性〔9〕，且能帮助纳米粒穿过细胞屏障，利于细胞摄取，能够获得良好的MR图像对比〔10〕。

本研究成功构建壳聚糖修饰的VEGFR-2靶向MR分子探针及非靶向探针。SPIO和anti-VEGFR2-CS@SPION在电子显微镜下颗粒形态较规则，呈球形，分散性良好，具有良好的生物相容性与稳定性，表明SPIO表面修饰壳聚糖后稳定性增加，且保持原有的生物活性。弛豫率是反映造影剂性能的主要参数之一，弛豫率大则T2信号减低，造影剂的成像效果也越显著〔11〕。SPIO与抗VEGFR-2抗体结合后MR显像特性没有改变。另外，anti-VEGFR2-CS@SPION不影响细胞存活率，为进一步体外MR研究提供了可靠的保障。经激光共聚焦显微镜及普鲁士蓝染色法验证，VEGFR-2抗体造影剂可以与肝癌细胞特异性结合，对肝癌细胞具有很好的靶向效果。体外MR证实VEGFR-2抗体造影剂与肝癌细胞结合后信号强度显著降低，具有肝癌细胞特异性靶向增强效果。

综上，本实验构建的壳聚糖修饰的VEGFR-2抗体负载SPIO纳米探针具有无毒、良好的生物相容性及理化性质，体外细胞结合实验及体外细胞MR成像证明抗体造影剂对肝癌细胞具有很好的靶向性，可为肝癌特异性诊断提供依据，也为肿瘤血管生成的深入研究奠定实验基础。

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7 Ferrara N，Gerber HP，LeCouter J.The biology of VEGF and its receptors〔J〕.Nat Med，2003；9(6)：669-76.

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9 金光玉，李德奇，夏 雷，等.壳聚糖-乳糖酸-超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备及体内磁共振成像中的应用〔J〕.延边大学医学学报，2014；37(4)：157-60.

10 Chen HJ，Zhang ZH，Luo LJ，etal.Surface-imprinted chitosan-coated magnetic nanoparticles modified multi-walled carbon nanotubes biosensor for detection of bovine serum albumin〔J〕.Sensors Actuators B Chem，2012；163(1)：76-83.

11 杨蕊梦，李楠楠，张黎明，等.肿瘤CD44受体靶向性超顺磁性氧化铁-透明质酸分子探针的构建及体外靶向作用〔J〕.2014；48(5)：363-8.

〔2016-11-29修回〕

(编辑 李相军)

Preparation of VEGFR-2-loaded superparamagnetic iron oxide nanoprobes and MRI molecular imaging with liver cancer cells

MEI Ping，QUAN Ji-Shan，SONG Xiao-Wei，etal.

The Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, Jilin, China

Objective To prepare a targeting MR molecular probe with vascular endothelial growth factor receptor(VEGFR)-2, to determine the specific targeting function in human hepatoma cell.Methods The superparamagnetic iron oxide nanoparticles was prepared by coprecipitation methods, then the VEGFR-2-loaded MR molecular probe waS prepared by modifying SPIO with chitosan in surface and coupling anti-VEGFR2. The SPIO nanoparticles with unmodified was treated as control group. The particle size, distributed and Zeta potential were tested by DLS, its T2 relaxivity rate was tested by 3.0T MR. The security of probe was determined by MTT assay. The combination probe in HepG2 cell was detected by laser confocal microscopy.Results The particle sizes of SPIO and anti-VEGFR2-CS@SPION were 20.6 nm and 38.4 nm respectiviey, the Zeta potentials were (20.3±1.32) mV and (3.58±1.28) mV respectively, and the T2 relaxivity rates were 0.179×106M-1S-1and 0.201×106M-1S-1respectively. The laser confocal microscopy showed HepG2 cell specific binding with antibody probe. More blue-stained particles appeared in cells. But only few blue-stained particles appeared in control group. T2 values of anti-VEGFR2-CS@SPION, simple SPIO and empty control groups were (55.6± 1.4) ms, (99.8±0.77) ms and (110.8±0.95) ms respectively, there were significant differences (F=317.547，P<0.01) between them.Conclusions The anti-VEGFR2 molecular probe modified by chitosan and labeled by SPIO has good biological characteristics and vitro MR imaging for hepatoma cell.

VEGFR-2；Superparamagnetic iron oxide particle；Chitosan；Tumor targeting；Molecular magnetic resonance imaging

国家自然科学基金资助项目( No.81160176)；吉林省科技发展计划项目(20150101199JC)

金光玉(1975-)，女，博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事分子影像学研究。

梅 苹(1992-)，女，在读硕士，主要从事分子影像学研究。

R445

A

1005-9202(2017)14-3406-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.011

1 延边大学药学院 2 延边大学解剖学教研室