Toll样受体4和核因子-κB在颅内动脉瘤组织中的表达及作用机制

王俊凯

(甘肃省人民医院西院区神经外科，甘肃 兰州 730050)



Toll样受体4和核因子-κB在颅内动脉瘤组织中的表达及作用机制

王俊凯

(甘肃省人民医院西院区神经外科，甘肃 兰州 730050)

目的 探讨Toll样受体(TLR)4和核因子(NF)-κB在颅内动脉瘤组织中的表达及作用机制。方法 在开颅动脉瘤夹闭术中收集18例动脉瘤标本，根据Hunt-hess标准分为破裂组10例、未破裂组8例；取开颅夹闭术中获取入路同侧血管10份为正常对照组。分别行光镜和电镜观察标本病理学改变，α-actin染色结合电镜观察计算出血管平滑肌细胞密度；免疫组化法检测标本中TLR4、NF-κB、CD68、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3表达水平；RT-PCR和Western印迹检测标本中TLR4、NF-κB mRNA和蛋白的相对表达量。结果 动脉瘤血管壁分布有少量阳性平滑肌细胞，而正常血管壁平滑肌细胞α-actin染色几乎均为阳性，其中破裂组、未破裂组的血管平滑肌细胞密度明显低于正常对照组(P<0.01)；破裂组血管平滑肌细胞密度明显低于未破裂组(P<0.05)。破裂组、未破裂组TLR4、NF-κB、CD68、Caspase-3表达水平明显高于正常对照组，破裂组明显高于未破裂组(P<0.05)。破裂组、未破裂组TLR4 和NF-κB mRNA和蛋白的相对表达量均明显高于正常对照组，破裂组明显高于未破裂组(P<0.05)。结论 TLR4/NF-κB信号通路在血管内皮损伤介导的颅内动脉瘤血管壁炎性反应和平滑肌细胞介导的退行性病变过程中发挥重要作用。

颅内动脉瘤；Toll样受体4；核因子-κB

颅内动脉瘤形成过程与免疫炎症密切相关，但其起源和机制仍未完全明确。核因子(NF)-κB是炎症细胞因子的主要调节子，相关研究显示，NF-κB信号传导在内皮细胞损伤介导的血管性疾病中发挥重要作用，TLR可激活NF-κB的信号传导途径〔1〕。TLR4是人体中首个发现的TLR，因其启动炎性反应的作用明显而在多种疾病发展过程中均已有研究报道〔2〕，但关于其在颅内动脉瘤发病机制中的作用研究极少。本研究旨在探讨TLR4/NF-κB信号通路在颅内动脉瘤发病中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2016年10月在甘肃省人民医院行开颅动脉瘤夹闭术，在保证手术安全前提下获取的标本18例。其中男6例，女12例，年龄56～78岁，平均(67.95±9.01)岁；动脉瘤分布：前交通5例、左后交通3例、右后交通4例、左大脑中3例、右大脑中3例，患者均无颅内多发动脉瘤；根据Hunt-hess标准分为破裂组10例、未破裂组8例。在知情同意的前提下，在患者开颅夹闭术中获取入路同侧血管10份为正常对照组。

1.2 主要试剂 TLR4单克隆抗体(工作浓度1∶200)购于上海信裕生物科技有限公司；NF-κB p65抗体(工作浓度1∶100)、CD68单克隆抗体(工作浓度1∶100)购于上海康朗生物科技有限公司；α-actin多克隆抗体(工作浓度1∶100)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3多克隆抗体(工作浓度1∶200)购于艾博抗(上海)贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病理学观察 将术中切取的动脉瘤夹远端瘤壁标本分为两部分，其中一部分用4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋、切片、苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察。另一部分用3%戊二醛固定，丙酮梯度脱水，包埋后半薄切片光学定位，超薄切片，枸橼酸铅和醋酸铀双染色后电子显微镜下观察。根据Lopez-candales标准观察并计算出每个标本的平均血管平滑肌细胞密度。

1.3.2 免疫组化检测 标本用4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，5 μm连线切片。常规进行二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱苯、水化后按试剂盒说明分别加入抗TLR4、抗NF-κB p65、抗CD68、抗Caspase-3以及抗α-actin一抗和二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色后每张标本切片进行指标染色，共5张切片完成上述指标免疫组化染色，用磷酸缓冲液(PBS)代替为一抗作阴性对照，用厂家提供的已知表达的上述指标切片为阳性对照。根据Takagi半定量积分标准：无染色为0分；轻度染色为1分；中度为2分；重度为3分。

1.3.3 RT-PCR检测 Trizol法提取TLR4、NF-κB稳定表达的标本组织细胞中的总RNA并逆转录为cDNA。RT-PCR反应体系20 μl，反应条件：95℃ 5 min，95℃ 45 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共进行40个循环，72℃延伸10 min。扩增引物由南京信帆生物技术有限公司合成。以无cDNA模板的反应体系为空白对照；β-actin为内对照。扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，扫描各条带灰度值。

1.3.4 Western印迹检测 取20 mg脑动脉瘤标本和正常脑血管组织标本提取总蛋白，同时测定总蛋白浓度。行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，湿法转膜，免疫杂交后发光法测定目的蛋白，图像分析软件测定蛋白条带的灰度值，以TLR4、NF-κB与β-actin的比值为相对表达量。

1.4 统计学分析 采用SPSS11.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 光学显微镜和电子显微镜观察情况 HE染色后光学显微镜下观察显示，动脉瘤壁变薄并向外膨出，部分存在淡黄色动脉硬化；动脉瘤内皮细胞空泡变性，管腔中存在血栓；平滑肌细胞厚度减少，中膜、外膜存在明显炎性细胞浸润；局部存在内膜增生。枸橼酸铅和醋酸铀双染色后电子显微镜下观察显示，内皮细胞空泡变性，平滑肌细胞数目减少，部分染色细胞核固缩，细胞质和细胞核部分裂解为碎片，局部出现无细胞区；动脉瘤外膜厚度变薄，可见炎性细胞浸润，内部结构破坏，胞外基质错乱不清。

2.2 血管平滑肌细胞密度和标本中免疫指标表达情况 动脉瘤血管壁分布有少量阳性平滑肌细胞，而正常血管壁平滑肌细胞α-actin染色几乎均为阳性。破裂组、未破裂组血管平滑肌细胞密度〔(49.05±6.39)、(52.61±6.80)〕明显低于正常对照组〔(221.57±10.35)，P<0.01〕；破裂组明显低于未破裂组(P<0.05)。破裂组、未破裂组TLR4、NF-κB、CD68、Caspase-3表达水平均明显高于正常对照组(P<0.05)；破裂组TLR4、NF-κB、CD68、Caspase-3表达水平均明显高于未破裂组(P<0.05)。见表1。

2.3 不同血管壁中TLR4和NF-κB mRNA表达情况 RT-PCR检测显示，破裂组、未破裂组、正常对照组TLR4 mRNA相对表达量分别为(8.31±1.08)、(6.12±0.85)、(1.48±0.92)；NF-κB mRNA分别为(15.93±3.18)、(10.42±1.87)、(3.19±0.86)。破裂组、未破裂组TLR4 和NF-κB mRNA表达水平均明显高于正常对照组，破裂组高于未破裂组(P<0.05)。见图1。

2.4 不同血管壁中TLR4和NF-κB mRNA蛋白表达情况 Western印迹检测显示，破裂组、未破裂组、正常对照组TLR4 蛋白相对表达量分别为(6.96±0.80)、(5.08±0.52)、(1.31±0.09)；NF-κB 蛋白相对表达量分别为(14.82±2.05)、(7.36±1.13)、(3.15±0.60)。破裂组、未破裂组TLR4 和NF-κB 蛋白表达水平均明显高于正常对照组，破裂组高于未破裂组(P<0.05)。见图2。

表1 3组不同血管壁标本中免疫指标表达情况

与正常对照组比较：1)P<0.05；与未破裂组比较：2)P<0.05

图1 RT-PCR检测TLR4和NF-κB mRNA表达情况

图2 Western印迹检测TLR4和NF-κB 蛋白表达情况

3 讨 论

动脉壁血流切应力是颅内动脉瘤形成的关键因素，动脉壁炎症反应是动脉病变的共同病理生理学基础〔3〕。因此，颅内动脉血管异常血流切应力和炎症反应在颅内动脉瘤形成和发展中发挥重要作用，其中NF-κB是形成的关键因子。NF-κB活化后既可调节免疫反应中的相关基因，还可转录性上调炎症相关基因的表达〔4〕。TLR是目前人体中发现的唯一能够将胞外抗原信息传递到胞内的跨膜蛋白，是炎症反应的起点和调控点，涉及动脉硬化等一些列炎性疾病的发生和发展。相关研究显示，TLRs家族在调控免疫反应的同时还与多种炎症性疾病相关，如TLR2、4参与肺部病原菌感染〔4〕，TLR4、5参与炎性肠道疾病过程〔5〕。TLR4是在哺乳动物中首个发现的TLR，因其启动和放大炎性反应的作用明显，在多种疾病中发挥关键作用〔6〕，但其在颅内动脉瘤发病机制中的作用鲜有报道。

本研究提示在人动脉瘤形成过程中伴随着TLR4表达上调。NF-κB被激活在动脉瘤形成中也具有关键作用，相关研究显示，他汀类药物可通过抑制大鼠脑动脉瘤壁导致NF-κB被激活，抑制动脉瘤的中膜退变〔7〕。本研究进一步证实了NF-κB激活在人颅内动脉瘤组织发展中的促进作用。

本研究结果提示CD68、Caspase-3生成可能与动脉瘤形成过程中TLR4/NF-κB信号通路被激活有关。TLR4表达水平与NF-κB激活和炎性因子CD68、Caspase-3生成呈平行相关性，说明TLR4/NF-κB信号通路在血管内皮损伤介导的管壁炎性反应和平滑肌细胞介导的退行性病变过程中发挥重要作用。

1 梁爱军.老年颅内动脉瘤破裂出血的危险因素〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(20):5739-40.

2 Zhang Y,Chong W,Qian Y,etal.Investigation of intracranial aneurysm hemodynamics following flow diverter stent treatment〔J〕.Med Eng Phys,2013;35(5):608-15.

3 唐海涛,赵 江,付振宇,等.老年颅内动脉瘤破裂致蛛网膜下腔出血患者死亡的危险因素〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(4):912-3.

4 许昌海,金红旭.持续性肾脏替代联合血必净对脓毒症患者炎症反应、免疫功能的影响〔J〕.中国卫生工程学,2016;(5):499-500.

5 张明铭,蒋宇钢.跨膜蛋白超家族TM9 SFI和炎性反应介质在颅内动脉瘤壁形成和破裂中的作用分析〔J〕.北华大学学报(自然科学版),2017;18(1):43-5.

6 Chen H,Selimovic A,Thompson H,etal.Investigating the influence of haemodynamic stimuli on intracranial aneurysm inception〔J〕.Ann Biomed Eng,2013;41(7):1492-504.

7 张明铭.颅内动脉瘤的miRNA、mRNA表达谱及其分子网络调控研究〔D〕.长沙：中南大学,2013.

〔2017-03-27修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)

王俊凯(1979-)，男，主治医师，主要从事神经外科研究。

R73

A

1005-9202(2017)14-3427-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.020