应激大鼠肠道树突细胞的免疫功能

李 蒙 张 璐 胡 玥 吕 宾

(浙江中医药大学附属第一医院消化科，浙江 杭州 310000)



应激大鼠肠道树突细胞的免疫功能

李 蒙 张 璐 胡 玥 吕 宾

(浙江中医药大学附属第一医院消化科，浙江 杭州 310000)

目的 研究应激大鼠肠道树突细胞(DC)表型及功能状态的改变。方法 选用20只雄性SD大鼠随机分为对照组、实验组，各10只。给予实验组大鼠结直肠扩张联合束缚刺激，对照组大鼠不处理，采用大鼠腹部收缩反射(AWR)对两组大鼠进行直肠气囊扩张，测量肠道容量感觉阈值。成功建立模型后，磁珠分选技术分离肠系膜淋巴结DC，检测其表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ、Toll样受体(TLR)4的表达，将MLNDC与脾脏单个核细胞体外混合培养，流式标记CD4+/CD8+T淋巴细胞，检测MLNDC促CD4+/CD8+T淋巴细胞增殖的能力。结果 实验组大鼠的疼痛阈值明显低于对照组(P<0.05)；实验组大鼠MLNDC表达MHCⅡ水平高于对照组(P<0.05)，而表达CD80、CD86、MHCI与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；实验组大鼠MLNDC表达TLR4高于对照组(P<0.05)；与对照组相比，实验组大鼠MLNDC促CD4+/CD8+T淋巴细胞增殖能力增强(P>0.05)。结论 大鼠应激刺激后肠道DC上调表达TLR4，刺激其本身分化成熟，进一步表达MHCⅡ，后者通过介导T淋巴细胞活化，引起肠道低度炎症，从而引起肠道内脏高敏感的产生。

应激；树突细胞；Toll样受体4

树突细胞(DC)具有抗原递呈作用，DC的树突经紧密连接能对抗原进行直接识别，或其胞体能间接接受M细胞递呈抗原，DC产生的信息能诱导免疫激活、免疫耐受，与癌症发生、发展存在一定关联〔1,2〕。成熟DC能介导细胞免疫应答、体液免疫应答，未成熟DC细胞能诱导免疫抑制、免疫耐受，通过检测DC相关细胞因子表达能对DC在炎症发生机制中可能起到的作用进行探讨〔3,4〕。肠易激综合征(IBS)是一种常见的消化道疾病，治疗难度大，多与肠道感染、免疫、肠道菌群失调等有关，但发病机制、病因尚未完全明确，是国内外医学研究的重难点〔5,6〕。本研究拟进一步探讨应激对肠黏膜免疫功能的影响，对大鼠肠道DC进行分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选用20只雄性SD大鼠，体重(182.0±18.0)g，6～8周龄，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供。实验前2 w将所有大鼠放进25℃恒温饲养室，安排专人饲养，维持12 h∶12 h的昼夜交替，根据所需原则为大鼠提供水、食物。

1.2 方法

1.2.1 建立模型与分组 所有大鼠饲养2 w后随机分为实验组、对照组，各10只。实验组大鼠采用结直肠扩张联合束缚应激建立应激大鼠模型，实验组大鼠采用结直肠扩张刺激2 w：8F气囊导尿管以石蜡润滑后经肛门插入直肠，气囊远端距肛门1 cm，导尿管肛门外部分以棉线固定鼠尾根部，以60 mmHg气囊压力予以刺激，2次/d，间隔30 min，每次持续1 min。结直肠扩张刺激结束后予以束缚应激5 d：大鼠置入特殊制动笼器内，束缚前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓头面部，可少许前后活动，束缚时间为2 h。正常对照组大鼠不予任何刺激，结直肠扩张联合束缚应激共19 d。造模结束后，实验研究者采用国际通用的大鼠腹部收缩反射(AWR)评分标准评估肠道敏感性，具体方法如下：将大鼠于清醒状态，不限制其活动情况下将8F带气囊导尿管外涂石蜡后经肛门插入，气囊末端距肛缘1 cm。导尿管肛门外部分以棉线固定鼠尾根部。30 min后大鼠适应环境呈安静状态，扩张球囊使球囊内压力逐渐升高，观察腹部抬离桌面(AWR=3)时的气囊压力，由非实验者记录AWR=3时的球囊压力，共进行3次，每次持续30 s，间隔3 min，取平均压力值。

1.2.2 采集标本 模型建立成功后，将大鼠处死，浸入75%酒精10 min后置于超净台内，快速剖腹取脾脏，玻璃棒轻敲，剪刀剪小破口，使被膜下组织碎块流出，可以附加碾碎，200目滤网过滤，获得单细胞悬液；在无菌条件下，将小肠翻出体外，见在肠系膜近根部存在一排粟粒状淋巴结，取下淋巴结，置入无血清RPMI1640备用。

1.2.3 分离肠系膜淋巴结DC(MLNDC) 将置入无血清RPMI1640的淋巴结用无菌载玻片将组织块碾磨并过滤铜网，制成悬浮液体，离心10 min，PBS重悬并离心2次；以含10%胎牛血清的RPMI1640(含双抗)悬浮细胞，细胞计数，离心弃上清，每107个细胞加入80 μl缓冲液和20 μl Anti-RatDC(OX62)MicroBeads(德国Miltenyi公司)，混匀，在冰箱(4℃～8℃)孵育15 min，严格按照说明书分选OX62+DC，所获细胞悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640全培养基中。将分离得到的肠道单个核细胞均与PE标记的OX62抗体孵育，4℃，避光30 min。同时孵育同型对照抗体。流式细胞仪检测，CellQuest软件进行分析。细胞活力检测：将0.4%台盼兰和分离前后的细胞悬液以1∶1混合后镜下观察并计数染色细胞比例。

1.2.4 检测肠道MLNDC表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ、Toll样受体(TLR)4的表达 各组MLNDC调整至1×107/ml，PBS漂洗离心后重悬约0.5 ml，分别与APC标记的MHCⅠ抗体、FITC标记的MHCⅡ抗体、APC标记的CD86抗体、FITC标记的CD80抗体、PE标记的TLR4抗体孵育(美国eBioseience公司)，4℃，避光30 min，1 ml PBS漂洗，离心后以0.5 ml重悬，同时孵育各自同型对照抗体。流式细胞仪检测相应荧光强度，Cell Quest软件对结果进行分析。

1.2.5 检测MLNDC促T淋巴细胞增殖能力 将获得的脾脏单细胞悬液离心10 min，PBS重悬离心10 min共2次，离心后以含10%胎牛血清的RPMI1640(含双抗)悬浮细胞，采用大鼠淋巴细胞分离液按照说明书要求密度梯度离心(20℃，20 min)，将分离得到的单个核细胞用RPMI1640培养液稀释到1×107/ml细胞悬液备用。

CFSE标记脾脏单个核细胞：使用DMSO配制5 mmol/L CFSE母液，在避光环境中，110 μl PBS溶液中加入1.1 μl的CFSE母液，迅速混匀，转入已备好的1 ml单个核细胞悬液中，充分混匀，室温反应5 min，加入10 ml含有5%灭活FBS的PBS液终止标记，离心5 min，收集沉淀，以含5%灭活FBS的PBS液离心5 min漂洗2遍，收集离心后沉淀，用含10%FBS的RPMI1640培养基重悬，制备CFSE标记的单个核细胞悬液。

将分离得到的MLNDCs调整浓度至5×106/ml，用含10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液(含双抗)悬浮，分别以0.1 ml DC(5×105细胞/孔)加入96孔细胞培养板，每组设3复孔，每孔预孵育OVA(10 ng/ml)2 h，再加入同种大鼠脾脏CFSE标记的单个核细胞悬液0.1 ml(MLNDC与其细胞浓度比值为1∶1)，另设MLNDC、脾脏单个核细胞单独培养组，在含5%的CO2的37℃恒温培养箱内培养7 d，分别用抗CD4-PE及抗CD8-PE抗体标记表面分子，流式细胞仪检测，以CFSE为第一荧光，PE标记抗体为第二荧光，用Cell Quest软件获取数据，Modfit软件分析不同细胞亚群的CFSE。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0软件，计数资料组间比较采用χ2检验，计量资料采用t检验。

2 结 果

2.1 模型验证结果 造模后大鼠逐渐表现为大便质稀、焦躁及体重减轻等，对照组大鼠一般情况良好。造模结束后第3天，以AWR=3分时所需的气囊压力作为评价指标进行模型验证，结果实验组较对照组大鼠内脏敏感性显著增高，感觉阈值实验组(69.4±3.72)mmHg，对照组(84.2±3.61)mmHg(P<0.05)，提示应激模型成功建立。

2.2 流式细胞术检测OX62+MLNDC分选结果 平均每1只成年雄性SD大鼠的肠系膜淋巴结经磁珠分选后可获得约1×107个MLNDC，收集磁珠分选后的MLNDCs，流式细胞术检测显示OX62阳性率为87.91%±8.12%，台盼蓝染色后镜下观察并计数显示细胞活性>90%。

2.3 MLNDC表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ、TLR4的表达水平 流式检测结果表明，与对照组相比，实验室小鼠MLNDC表面高表达MHCⅡ类分子(P<0.05)，而CD86、CD80及MHCⅠ类分子的表达无明显变化(P>0.05)；与对照组相比，实验室小鼠MLNDC表面高表达TLR4(P<0.05)，见表1。

表1 两组大鼠MLNDC表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ、TLR4、TLR9的表达

与对照组相比：1)P<0.05

2.4 MLNDC促T淋巴细胞增殖能力 与对照组相比，实验组大鼠肠道MLNDC可以显著促进CD4+及CD8+T淋巴细胞增殖，见图1。

图1 流式细胞术检测CD4+、CD8+T细胞表达

3 讨 论

DC是目前所知的功能最强的抗原提呈细胞，能对一系列外来病原体信号进行整合，并传递至淋巴细胞，使适宜的免疫应答反应启动〔7〕。成熟DC的吞噬能力降低，但细胞表面的共刺激分子、黏附分子的相关表达增高，促使促炎症细胞因子分泌，使初始T细胞介导的相关免疫应答反应启动；而未成熟的DC通过微生物感染、移植后识别及吞噬外源性抗原，能快速成熟〔8,9〕。DC广泛分布于多种组织，在肠道黏膜免疫系统，DC主要分布于肠道黏膜固有层、Peyer结和肠系膜淋巴结，其中分布于肠道黏膜固有层、Peyer结的DC可以直接摄取抗原或通过伸出树突进入肠腔内摄取抗原以呈递给T细胞而引起免疫应答反应。DC可通过向T细胞提供活化所必需的抗原肽-MHC第一信号及CD80、CD86(即B7-Ⅰ、B7-Ⅱ)等共刺激分子第二信号，诱导初始型T细胞(Th0)向Th1和Th2分化并启动T细胞免疫应答，分别产生特征性细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ(Th1途径)及IL-4、IL-5、IL-9(Th2途径)。DC表达的Ⅰ类和Ⅱ类MHC分子是抗原多肽的载体，分别提呈内源性和外源性抗原肽，介导CD8+及CD4+T淋巴细胞增殖活化。本研究结果说明，大鼠肠道MLNDC本身处于一个比较成熟的状态，应激刺激进一步促使MLNDC上调表达MHCⅡ，刺激T淋巴细胞活化能力增强，引起其成熟水平的进一步提高。

DC表面表达多种模式识别受体，其中TLR就是一类重要的模式识别受体，在识别微生物感染的过程中发挥重要作用。TLRs识别病原体的一些高度保守的分子结构即病原体相关分子模式而启动固有免疫应答，介导抗感染免疫。TLRs在DC和巨噬细胞等专职抗原提呈细胞表面，表达尤其丰富。其中，TLR4在DCs分化和功能成熟过程中发挥着关键的作用，TLR4可以识别来源于肠腔的革兰阴性菌细胞壁成分脂多糖，通过胞内的相应信号通路传递信息，诱导DCs成熟，并促使其分泌细胞因子，活化T细胞，诱导特异性免疫应答。本研究发现，应激大鼠肠道中，上调表达的TLR4可以通过识别相应配体引起DC成熟活化，主要表现为表面MHCⅡ的上调表达，后者进一步刺激T淋巴细胞活化，引起大鼠肠道低度炎症的产生，从而介导应激相关内脏高敏感。

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〔2017-01-20修回〕

(编辑 李相军)

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The immune function of intestinal dendritic cell in stressed rats

LI Meng,ZHANG Lu,HU Yue,etal.

Department of Digestive,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310000,Zhejiang,China

Objective To analyze the phenotype and function of intestinal dendritic cell (DC) in stressed rats.Methods 20 male SD rats were randomly divided into experimental and control groups,10 cases in each. Experimental group was established by combining colorectal distention with restraint stress,which underwent abdominal withdrawal reflex (AWR) to evaluate visceral sensitivity. After successful modeling,mesenteric lymph node DC (MLNDC) of rats was isolated and purified by magnetic label-based technique. The surface marker CD80,CD86,MHC Ⅰ,MHC Ⅱ,TLR 4 of MLNDC were tested by the technique of flow cytometry,and mixed lymphocyte reaction (MLR) was used to evaluate the capacity to stimulate T cell proliferation. Results The OX62 positivity cell population following magnetic sorting was about 87.91%±8.12%. Compared with control group，high level of MHC Ⅱ was expressed on the surface of MLNDCs (P<0.05),whereas the expression of CD80,CD86,and MHC Ⅰ were not significant (P>0.05). Compared with control group，high level of TLR4 was expressed on the surface of MLNDCs (P<0.05).CD4+or CD8+T cells proliferated when the DC/T ratio was increased. Conclusions Stress induces the increased expression of TLR4 in rats MLNDC,which stimulates T cells proliferation by upregulating the surface maker of MHC Ⅱ,resulting in the generation of intestinal low-grade inflammation and visceral hypersensitivity in IBS rats.

Stress;Dendritic cells;Toll-like receptors 4

国家自然科学基金资助项目(81600426)

吕 宾(1963-)，男，主任医师，主要从事消化病研究。

李 蒙(1986-)，女，博士，住院医师，主要从事胃肠道疾病研究。

R56

A

1005-9202(2017)14-3386-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.003